第 一 節 病 患 及 實 驗 組 織 檢 體 之 收 集
本實驗所有檢體皆取自民國 91 年 10 月至 92 年 4 月間，至中國醫藥 學院附設醫院耳鼻喉科就診之患者。以隨機方式給予人工合成之皮質 類固醇水性鼻噴劑 budesonide (商品名 Pulmicort)，給藥劑量及方法如 下:
經由鼻腔給藥，一天一次、每次每個鼻孔分別提供二個噴劑的藥量 ( 100mg/噴劑)，一天的總劑量為 400 mg，治療至少持續四星期。
鼻息肉組織檢體(以下稱為鼻息肉組織:NP)取自 12 位經內視鏡及斷層 掃瞄確定為鼻息肉且接受 budesonide 治療之病患。而控制組檢體則取 自 12 位非鼻息肉診斷且接受 budesonide治療病患的下鼻甲組織(以下 稱為控制組織:IT)。
經皮質類固醇治療四星期後，所有組織檢體皆以內視鏡手術方式取
得，並將取得的組織立刻放入液態氮，之後放在-80°C 冰箱保存直到 要做分析時才取出。
第二節 組織蛋白質抽取
1.儀器:
l 均質機 Polytron PT 3100 (POLYTRON ,Luzernerstrasse,Switzerland) l 超音波震盪器 SonicaterXL-2020
(MISONIX,Farmingdale,NY,USA)
（GERBU,Am Kirchwald, Germany）
l 150 mM NaCl
（MERCK,Darmstadt, Germany） 75 ml l 1 mM EDTA
（USB,Ohio,USA） 1 ml l 5mM EGTA
（SIGMA, ST.Louis, MO,USA） 2.5 ml l Tween 20
（USB,Ohio,USA）
l Glycerol
（MERCK,Darmstadt, Germany）
3.步驟:
將組織從-80°C 冰箱取出，取適度大小的組織約 0.5×0.5×0.5 ㎝剪碎，
放入養菌管中，每 0.5 公克組織加入 500 µl Sheer’s buffer。將組織倒 入 dounce grinder 中，輕輕轉動、研磨，將研磨出之液體收集在 microtubule 中，用 sonicater 將細胞震破均質，時間勿持續超過 30 秒，
冰上冷卻後再繼續均質。再將均質好的樣品在 4℃時離心 13000 RPM
× 10 分鐘，取其上清液保存於－20℃。
第三節 組織蛋白質定量 1. 應用原理
Bradfor dreagent 的 dye-binding method 是利用 Coomassie brilliant blue G-250 (CBG) 可與蛋白質結合而變色的特性來定量 ( Bradford, 1976)；若試樣中的蛋白質量較多，則結合到蛋白質而變色的 CBG 也 多，因而呈色較深。先以一組標準蛋白質 Bovine serum albumin (BSA) 為對象，製作一條蛋白質量與吸光度的標準校正線。
2. 儀器:
(BIO-RAD, Hercules,California,USA)
— Bovine serum albumin(BSA) (SIGMA, ST.Louis,MO,USA)
4.步驟:
先將 ELISA 光度計電源打開暖機 30 分鐘，設定波長為 590nm。取 6 個薄壁微量管分別標示 0,5,10,15,20,25 並個別加入二次水, Bradford, Bovine serum albumin (BSA)，依照下列表格進行蛋白質量與吸光度的 標準校正線:
well plate 利用 590nm 波長測定吸光值微量滴定盤中以 ELISA 光度計 測其吸光值，以製作 standard curve，其 R-squared 值在 0.980~0.999 之間。
5.樣品蛋白質濃度測定:
再取薄壁微量管製作待測樣本：10ul sample 加 200ul Bradford 加入 790ul 二次水，同樣地等反應 5 分鐘後放入 96well plate 利用 590nm 波長測定吸光值分光光度計中測吸光值，再以 standard curve 所求出 的方程式換算出樣本蛋白質濃度。
第四節 蛋白質電泳分析 1. 應用原理
採用 SDS-PAGE，偵測目標蛋白質之位置 2. 儀器用具：
l 造膠台 Hoefer mini VE
( Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA) l Power supply OWL OSP-135
(Hoefer,San Francisco, USA) l Power supply PS500 XT DC
( Hoefer,San Francisco,USA) 3.藥品試劑:
A.上下層膠
（Pharmacia Biotech,Uppsala,Swedan）
l 1.0M Tris．HCl (pH 6.8)
（Pharmacia Biotech,Uppsala,Swedan）
l 10% SDS
（USB,Ohio,USA）
l 40% acrylamide /Bis solution
( BIO-RAD, Hercules,California,USA) l 10% APS
（USB,Ohio,USA）
l TEMED
（Pharmacia Biotech,Uppsala,Swedan）
B.染劑(4×dye):
l Glycerol 2 ml
（MERCK,Darmstadt, Germany）
l 2-mercaptoethanol 1 ml
（SIGMA, ST.Louis, MO,USA）
l 20﹪SDS 3 ml
（USB,Ohio,USA）
l 1M Tris．HCl（pH6.8） 2.5 ml
（USB,Ohio,USA）
l Tris（Pharmacia Biotech,Uppsala,Swedan）
l Glycine（USB,Ohio,USA） 57.6 g l SDS （USB,Ohio,USA）
D. Rainbow Marker
(BIO-RAD,Hercules,California,USA)
E.0.1% Commassie blue
l Coomassie brillant bule 0.25g
（USB,Ohio,USA）
l Methanol 45 ml
（TEDIA,Fairfield,Ohio,USA）
l Glyaceial acetic acid 10 ml
（MERCK,Darmstadt,Germany）
加入二次水到 100 ml
4. 步驟 :
準備一組鑄膠器，以酒精拭淨，組合後直立，準備 SDS 膠體溶液
依序如上表所列之藥品試劑。常用之膠體百分比為 10﹪~12﹪共需 下層膠體溶液 10 ml 與上層膠體溶液 4 ml。將下層膠體溶液倒入鑄 膠組合到 8 成高，儘量不要產生氣泡，再輕輕小心加上一層水層，
靜置 30 分鐘。倒去水層，加上層膠體溶液到滿，並插入樣品槽齒 模，靜置 30 分鐘、取下齒模即可進行電泳。將鑄好的膠及膠台放 入電泳槽中，倒入 Running buffer，並用 dropper 抽吸將 Gel 下方的 氣泡去除。鑄好的膠先以上 100V、300mA 預跑 15 分鐘。將預 loading 的蛋白質置入乾浴器 95°C 加熱 5分鐘後取出冷卻。將蛋白質 sample 15 µl 及 standard marker 7 µl 分別 loading 到各 Well 中，以 100V、
300mA 跑膠 1 小時 30 分鐘。
第 五 節 西 方 墨 漬 法 ( Western blot ) 1. 應用原理:
轉印電泳後膠体上的蛋白質色帶轉印到硝化纖維 (nitrocellulose) 紙，再以免疫染色法 (immunostaining) 專一性地染出目標分子。
2.儀器用具：
l Power supply OWL OSP-135 (Hoefer,San Francisco, USA) l Power supply PS500 XT DC
(Hoefer,San Francisco, USA) l PVDF Membrane
(Hybond-P, Uppsala , Sweden)
l 3M papers（3M,ST. Paul Minnesota , USA）
l X-ray flim (Fujifilm,Kanagawa ,Japan)
l Developer (Kodak,Rochester, NY, USA) l Fixer (Kodak,Rochester, NY ,USA)
l ECL（Pierce,Rockford ,Illinois ,USA）內含 第一劑:supersignal west pico stable peroxide solution 第二劑:supersignal west pico luminol/enhancer solution
3.試劑:
A.Transfer buffer :
組 成 重 量 總容積
l Glycine（USB,Ohio,USA）
l Tris（Pharmacia Biotech,Uppsala,Swedan）
l Methanol（TEDIA,Fairfield,Ohio,USA）
B. PBST
加 0.1% Tween 20（USB,Ohio,USA）至 1X PBS
C. 5% fat free Milk
l Fat free milk（Anchor,Wellington,Newzealand） 2.5 g l Tween 20（USB,Ohio,USA）50µl
加 1X PBS 至 50 ml
D. 抗體 : 第一級抗體 :
Fas Ligand 1:1000
(BD Pharmingen ,California ,USA)
Fas 1:500
(BD Pharmingen ,California ,USA) caspase 8 1:1000
(BD Pharmingen ,California ,USA) caspase 9 1:1000
(BD Pharmingen ,California ,USA) caspase 3 1:1000
(BD Pharmingen ,California ,USA) PCNA 1:1000
(BD Pharmingen ,California ,USA) p21 1:1000
(BD Pharmingen ,California ,USA) p27 1:1000
(BD Pharmingen ,California ,USA) p53 1:500
(BD Pharmingen ,California ,USA) E2F1 1:500
(BD Pharmingen ,California ,USA) Phospho-Rb 1:500
(BD Pharmingen ,California ,USA) 第二級抗體 :
peroxidase-conjugated anti-mouse IgG (BD Pharmingen ,California ,USA) peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG (BD Pharmingen ,California ,USA)
3. 轉漬步驟:
進行轉漬時先將轉漬夾片的黑色面朝下，取海棉片 1 片浸泡轉漬 buffer 後放在其上。依序在海棉片上放 3M paper 2 片、Gel、PVDF membrane 1 片 ( 先用 100%甲醇濕潤 15 秒、再浸泡轉漬 buffer 1 分 鐘 )、3M paper 2 片，最後再放上 1 片海棉片。轉漬夾片合上並放入 轉漬 box ( 內置磁石 1 顆 )並加滿轉漬 buffer。將轉漬 box 放上攪拌 器，接電源供應器，按 DC 開始電源設定為 50 伏特， 整個儀器放進 4℃冰箱轉印時間 2 小時 30 分鐘。2 小時 30 分鐘後自轉漬 box 內取
出 gel 及 membrane。將 membrane 放入 5﹪milk 加 0.1﹪Tween in PBS
（即 0.1﹪PBST）blocking 1 小時後置於 0.1﹪PBST 泡一下以 3M paper 壓乾。membrane 放於封口袋內加入第一級抗體，封口機封好放入 4
℃冰箱隔夜（blocking）。隔日取出 membrane 置於 0.1﹪PBST 中 blocking 20 分鐘共 3 次。membrane 以 3M paper 壓乾放於封口袋內加 入第二級抗體，封口機封好置於室溫 blocking 1 小時。取出 membrane 置於 0.1﹪PBST 中 blocking 20 分鐘共 3 次。最後於暗房中, 將 membrane 加入 ECL（1）（2）劑各 0.5ml 以反應出螢光，片夾內置入 X-ray flim 與 membrane 進行壓片，再取出 X-ray flim ，進行顯影及 定影。Protein band 含量採 Kodak digital science 1D (ver.2.03)（Kodak, Rochester,NY, USA）軟體分析。
第 六 節 統 計 分 析 方 法
數據統計分析採用 Sigma plot 8.0(SPSS Inc, Chicago, Illinois, USA) 統 計軟體之 paired t-test，mean ± SE 表示各項結果平均值±標準誤，圖 中*表示與控制組相比 P < 0.05；當* P<0.05 時，表示該實驗數據有統 計學上的明顯差異。