第三章 實驗架構與方法
3-1 磁流體熱治療實驗硬體架構
在探討磁流體熱治療最關鍵的參數為腫瘤區域的溫度變化，我 們選用光纖溫度計以及紅外線溫度攝影機來量測腫瘤區域的溫度，其 中光纖溫度計主要是來量測腫瘤內的溫度變化，紅外線溫度攝影機是 來量測腫瘤表面的溫度變化。圖 3-1 為系統的架構圖，當磁場產生器 開啟進行實驗時，光纖溫度計和紅外線攝影機也會啟動，並且將所記 錄的溫度變化紀錄在電腦中。圖 3-2 為系統的示意圖。
圖 3-1 實驗架構圖
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3-2 系統示意圖
電腦 A 交流磁場產生器
光纖溫度計 控制器 紅外線熱像儀 C 紅外線熱像儀 C
D 線圈及 動物平台
B
SOURCE
DAQ
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3-2 磁流體熱治療實驗軟體整合
由於磁場產生器機台、光纖溫度計及紅外線溫度攝影機是三個 獨立運作的機器，每當實驗開始時，都要個別開啟開關來進行實驗，
在操作上有許多的不方便，因此我們使用 LABVIEW 軟體來整合三臺機 器，使用者只需要使用電腦腦開啟們所撰寫的程式，直接可以進行實 驗，圖 3-2 為熱治療系統整合軟體的使用者介面。
圖 3-2 軟體整合圖
可見光影像 紅外線影像
可見光影像 紅外線影像
A.交流磁場產生器開關 B.光纖溫度計讀值
C.紅外線攝影機
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圖 3-4 磁流體製做流程圖
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3-3-2 水基磁流體物理特性量測
磁流體有兩項重要的參數，分別為其飽和磁化率(可換算磁流體 濃度)以及粒徑分布。其中飽和磁化率會使用振動樣品磁力儀
(Vibrating Sample Magnetometer, VSM) 來量測，振動樣品磁力儀之原 理是利用電磁感應的原理，讓樣品在垂直方向振動，而在樣品的兩端 配置感應線圈，當樣品偶極磁振動影響兩端之感應線圈時，即可感應 產生交流訊號。接著將感應產生的交流訊號去除雜訊並且放大，最後 與標準磁鐵所產生的訊號做比較，得到的訊號大小正比於樣品的磁矩 大小。因此 VSM 經常量測各種材料的磁特性，如鐵磁性、順磁性、
反磁性物質等，因此在磁流體製程完畢後，量測其飽和磁化率，換算 為濃度後為 0.3 emu/g，如圖 3-5。
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圖 3-5 磁流體磁滯曲線
另外一項必須探討的磁流體特性，即其粒徑分布。我們使用雷射 動態散射粒徑分析儀來量測此特性，它的基本原理是散色原理中之動 態光散射法，當雷射光進入含有粒子的溶液中，雷射光會因碰到粒子 而產生隨時間改變的散射現象，最後再以散射光之變化計算其粒徑的 大小。因此我們使用雷射動態粒徑分析儀來確認磁流體的粒徑大小，
在學長的論文中曾使用不同平均粒徑的磁流體來做產熱測試，且發現 平均粒徑較小的磁流體的產熱測試結果較好，在我們實驗室中自製的 磁流體有不同的粒徑分布，其粒徑可分為 25~35 nm、45~55 nm、70 nm
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磁流體熱治療產熱效率中，試劑的特性相當重要，前述中提到 的兩項特性，一為飽和磁化率為 0.3 emu/g ，二為平均粒徑為 31.4 nm ，其中第二項粒徑的部分，在學長的論文中已確立小粒徑的磁性 奈米粒子產熱效率較好，因此我們也已經選用磁流體製程中，層析後 較小粒徑的部分來做未來的各項產熱測試。而濃度提升產熱效率也會 上升，所以使用離心管讓磁流體中的水分瀝出，藉此提高磁流體之磁 性濃度。首先將 10 c.c.之磁流體加入離心管中，接著放入離心機離心 30 分鐘，此時磁流體剩餘的量已減少，因此我們會再次加入 10 c.c.
之磁流體到離心管中，接著再次離心 30 分鐘，這時就能夠量測其磁 性濃度了。濃縮流程如圖 2-6，濃縮後之磁性濃度如圖 2-7，磁流體 之濃度已達 6 emu/g 了。
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圖 3-7 磁流體濃縮流程圖
圖 3-8 濃縮後磁流體之磁滯曲線
H (O.e)
M (emu / g)
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濃縮完畢後，為了讓磁流體具有物理標靶特性，因此我們會將磁流體 再混合油質，稱為磁流體熱治療試劑。
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3-4 細胞實驗
為了要確定本實驗的磁場以及試劑的安全性，我們進行了兩組
細胞實驗，並用細胞存活率 (MTT Assay)分析磁場以及試劑對細胞的影響。
3-4-1 細胞存活率分析( MTT Assay)
細胞存活率的原理為：
MTT 為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用於活細 胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶(SDH)和細胞色素 C 的作用下 四氮唑環會開裂，生成紫色的甲䐶( formazan )結晶，利用二甲基亞碸 ( Dimethyl sulfoxide，DMSO)將甲䐶溶解出來之後，再利用吸光度的測 定去評估有多少細胞存活，因為甲䐶結晶的生成量與活細胞數目成正 比。
3-4-2 磁場對細胞的影響
本實驗所用的細胞為正常老鼠肝臟細胞，實驗分為兩組，每一 組進行三重複。第一組為控制組，條件為在無磁場的環境下，溫度 25℃並進行實驗 20 分鐘。第二組為實驗組，條件為在有外加磁場下 (261 Oe，72 kHz )，溫度 25 度並進行實驗 20 分鐘，實驗結束後進 行細胞存活率分析，圖 3-1 為此實驗的流程圖。實驗結果為圖 3-2，
從此圖中可以得知，細胞在此磁場條件下不會死亡。
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3-4-3 試劑對細胞的影響
本實驗所使用的細胞為正常老鼠肝臟細胞，實驗分成控制組以 及實驗組，控制組為只加入 1c.c 的 PBS，實驗組加入試劑 1c.c，試 劑的濃度分別為 1 emu/g 、3 emu/g、6 emu/g、10 emu/g，每次實 驗進行三重重複，實驗進行 30 分鐘後將試劑使用 PBS 沖洗之後進行
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3-5 動物實驗
動物實驗選擇的動物為大鼠，實驗分為兩部分，第一部分是在 背上沒有腫瘤的大鼠背上注射試劑，探討試劑的產熱。第二部分是在 背上有腫瘤的老鼠腫瘤注射試劑，探討試劑產生的熱對於老鼠腫瘤的 影響。
3-5-1 無腫瘤老鼠注射試劑實驗
本實驗使用的試劑濃度為 7.8 emu /g ，體積為 1 c.c.，將試 劑注射到老鼠的皮層中，圖 3-5 為老鼠注射前後的照片，在將老鼠放 入線圈中，進行產熱實驗。
圖 3-5 試劑注射到老鼠背上
注射前 注射後
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圖 3-7 紅外線溫度攝影機結果 3-5-2 有腫瘤老鼠注射試劑實驗
本實驗動物選用一般的大鼠，實驗流程為，先在老鼠的背上種 下肝癌細胞，目的是要在老鼠的背上誘發腫瘤，當腫瘤體積達到 1.c.c 時，我們會挑選出來進行實驗。首先會先在腫瘤內注射試劑，並且使 用掃描式超導生醫感測儀(SSB) 量測磁訊號檢驗試劑是否有擴散，再 放入線圈中加熱 40 分鐘，磁場條件為 374 O.e 、頻率為 72 kHz，
並在這過程中使用光纖溫度計以及紅外線溫度攝影機量測腫瘤內部 和表面的溫度，之後每天量測腫瘤體積，檢查腫瘤是否有變小，最後
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會將腫瘤製做成切片並染色，目的是要看腫瘤區域的細胞是否有死 亡。
3-5-3 無熱治療的癌鼠腫瘤體積量測
本實驗為控制組，其目的是為了要跟有做熱治療的老鼠比較腫 瘤大小，驗證只有做熱治療的癌鼠腫瘤會有變小的趨勢，沒有做熱治 療的癌鼠腫瘤越來越大，每隻控制組的老鼠連續量測腫瘤四天，並且 計算腫瘤大小，四天之後進行 TUNEL 染色檢測，驗證是否有細胞死 亡。
3-6 TUNEL 染色檢測 (TUNEL Assay)
為了要驗證熱治療之後腫瘤內的細胞是否死亡，我們利用 TUNEL 染色來觀察，其原理為細胞死亡會使染色體斷裂成碎片，在 DNA 的斷 裂口可與末端轉移酶（TdT）作用，在使用去氧尿嘧啶三磷酸 (dUTP) 與 TdT 反應，由於 DUTP 上可以 coating 螢光，因此如果細胞死亡的 話可以從螢光顯微鏡下觀察到。此外，為了要確認細胞的位置，會使 用 DAPI 染劑染細胞核。圖 3-8 為做完熱治療組織切片染色完後在顯 微鏡下觀察的圖，圖 3-9 為沒有做熱治療組織切片染色完後在顯微鏡 下觀察的圖，從左到右分別為染 DAPI、染 TUNEL 以及兩者的組圖。
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圖 3-8 熱治療之後組織染 TUNEL 以及 DAPI 結果
圖 3-9 正常組織染 TUNEL 以及 DAPI 結果
從這兩組圖可以很明顯的發現，只有經過熱治療的腫瘤才會有 很大規模的細胞死亡，驗證熱治療是可以讓腫瘤內細胞大量死亡。
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