Fig. 12 脂締素增加帶 PPRE 促進子的啟動子活性。
Fig. 13 脂締素增加 HO-1 的啟動子活性。
Fig. 14 脂締素透過 PPARα 的活化保護細胞防止來自鐵質的傷害。
Fig. 15 HO-1 可保護細胞防止來自鐵質所造成的凋亡。
Fig. 16 HO-1 緩解鐵在細胞中的堆積現象。
Fig. 17 COX-2 可保護細胞防止來自鐵質所造成的凋亡。
Fig. 18 Iron dextran 造成細胞凋亡的情形 (TUNEL assay)。
Fig. 19 脂締素的抗發炎反應功能。
A
B
C
D
Fig. 1 脂締素在肝細胞中誘發脂締素在肝細胞中誘發脂締素在肝細胞中誘發脂締素在肝細胞中誘發 HO-1 及及及及 COX-2 的表現的表現的表現的表現，，，，並提高並提高並提高並提高 HO-1 的的的酵素的酵素酵素酵素活性活性活性活性。。。。
直接給予細胞脂締素後，在不同的時間點收下細胞。並用 RT-PCR 及西方墨點法分析。 (A)以西方墨點法分析：隨著給予的脂締素濃度 的上升，HO-1 及 COX-2 的誘發量也跟著上升。（B）RT-PCR 的結 果可看到，在給予脂締素二小時後，HO-1 及 COX-2 RNA 的量都有
上升。最大量出現在給藥後六小時，並可繼續到 24 小時。（C）以 西方墨點法分析，兩種蛋白的變化走勢和 RT-PCR 的結果類似。 (D) 脂締素可增加 HO-1 的活性，並在給藥後 12 小時出現最大值。
（*, P < 0.05 versus ctrl）
A
B
Fig. 2 脂締素脂締素脂締素脂締素改善不同濃度的鐵質對肝細胞的傷害改善不同濃度的鐵質對肝細胞的傷害改善不同濃度的鐵質對肝細胞的傷害改善不同濃度的鐵質對肝細胞的傷害。。。。
在給予不同濃度鐵質，以及脂締素 30 µg/ml 後，以西方墨點法 分析。（A）脂締素在給予鐵質濃度 20 µM 以下時可達到保護 細胞的作用，活化態 caspase 3 的表現量下降。而同時也能觀察 到 HO-1 和 COX-2 這兩個細胞保護的蛋白質被誘發的現象。
而在只給予鐵質刺激的組別中，也可以看到此誘發的現象。但 這個誘發的量並不足以保護細胞防止鐵質的傷害。（B）透過 鐵質的染色可以看到，在給予 iron dextran 的組別中有明顯的鐵 質沉積的現象；而在同時給予脂締素的組別，這個現象明顯的 被改善。
(*, P < 0.05 versus ctrl, #, P < 0.05 versus iron dextran 10
µM-treated group, &, P < 0.05 versus iron dextran 20 µM-treated group)
A B
C
Fig. 3 脂締素在肝細胞中活化脂締素在肝細胞中活化脂締素在肝細胞中活化脂締素在肝細胞中活化 AMPK 的訊息傳遞的訊息傳遞的訊息傳遞的訊息傳遞。。。。
以 AMPK 的抑制劑 Compound C 對細胞進行前處理後，再給予脂 締素。最後以西方墨點法分析。（A）20 分鐘時，可以觀察到磷酸化 AMPK 的表現量上升，而給予 Compound C 處理的組別則被反轉。(B) 60 分鐘時，給予脂締素處理的組別，磷酸化 PPARα 的表現量上升；
而給予 Compound C 的組別則沒有變化。（C）6 小時的時間點上，
給予脂締素的組別可以誘發 HO-1 及 COX-2 的表現，而給予 Compound C 的組別則此誘發反應會被反轉。
(*, P < 0.05 versus ctrl, #, P < 0.05 versus APN-treated group)
A B
C
Fig. 4 脂締素在肝細胞中不活化脂締素在肝細胞中不活化脂締素在肝細胞中不活化脂締素在肝細胞中不活化 p38 的訊息傳遞的訊息傳遞的訊息傳遞。的訊息傳遞。。。
以 p38 的抑制劑 SB 202190 對細胞進行前處理後，給予脂締素；再 以西方墨點法分析。（A）20 分鐘時，不論是否有給予抑制劑前處理 的組別，p38 的活化情形都沒有出現一個明顯的上升。（B）60 分鐘 時，p38 依然沒有出現活化態上升的情形；而給予脂締素的組別都出 現了 PPARα 被磷酸化的情形。不論是否有給予抑制劑，均不對 PPARα 的磷酸化造成影響。(C) 6 小時的時間點上，HO-1 及 COX-2 被誘發的情形也不受抑制劑的影響。
Fig. 5 脂締素促進脂締素促進脂締素促進脂締素促進 PPARα 的核轉移現象的核轉移現象的核轉移現象的核轉移現象。。。。
首先以 Compound C 對細胞進行前處理，再給予細胞脂締素。同時 以 PPARα 的促效劑 WY 14643 做為正調控。一小時後收下細胞進 行核質分離，再以西方墨點法分析。在給予脂締素及促效劑的組別中 可以看到 PPARα 出現了一個明顯的核轉移現象；而在以 Compound C 前處理的組別中，這個現象則會被反轉。
(*, P < 0.05 versus ctrl, #, P < 0.05 versus APN-treated group)
Fig. 6 脂締素在肝細胞中誘發脂締素在肝細胞中誘發脂締素在肝細胞中誘發脂締素在肝細胞中誘發 HO-1/COX-2 的表現的表現的表現的表現，，，，需透需透需透需透過過過 PPARα 過 的活化
的活化的活化 的活化。。。 。
先以 Compound C 或 PPARα 抑制劑 GW 6471 對細胞進行前處 理，再給予脂締素。 PPARα 促效劑 WY 14643 則做為一正調控的 組別。收下細胞後，以西方墨點法分析。結果可看到，在給予脂締素 或促效劑的組別中，HO-1 及 COX-2 均有一個明顯的誘發情形；而 在給予 Compound C 或 GW 6471 的組別中，這個誘發現象則被反轉。
A B
Fig. 7 透過透過透過透過轉染轉染轉染轉染 pcDNA-Flag-PPARα 可大幅增加可大幅增加可大幅增加可大幅增加 HO-1 及及及及 COX-2 的誘發現象
的誘發現象 的誘發現象 的誘發現象。。。 。
對肝細胞轉染帶 Flag-PPARα 的質體，同時也轉染空的質體作為控制 組。經過 48 小時後給予脂諦素作用並分析 1 小時上的 Flag-PPARα 融 合蛋白的核轉移現象，6 小時上的 HO-1 與 COX-2 的誘發情形。結 果可看到：給藥 1 小時後，融合蛋白出現明顯的核轉移；6 小時的 HO-1 與 COX-2 的誘發現象也更明顯的上升。
(*, P < 0.05 versus ctrl, #, P < 0.05 versus APN-treated pcDNA)
Fig. 8 給予脂締素後觀察給予脂締素後觀察給予脂締素後觀察給予脂締素後觀察 Flag-PPARα 的核轉移現象的核轉移現象的核轉移現象的核轉移現象 (螢光免疫染螢光免疫染螢光免疫染螢光免疫染 色
色 色 色)
首先對肝細胞轉染 Flag-PPARα 的質體，同時也轉染 pcDNA 單獨的 質體作為控制組。經過 48 小時後給予脂締素 1 小時，收下細胞進行 實驗。轉染帶 Flag-PPARα 的組別中可看到再投予脂締素後出現一個 很明顯的核轉移現象。
(A)~(D):以 Anti-Flag 作為一級抗體，再染 Texas Red (E)~(H):以 DAPI 進行核染色
A
B
Fig. 9 以核酸干擾技術以核酸干擾技術以核酸干擾技術以核酸干擾技術降低降低降低降低 PPARα 的表現可抑制的表現可抑制的表現可抑制 HO-1 及的表現可抑制 及及及 COX-2 的誘發
的誘發 的誘發 的誘發。。。 。
先轉染針對 PPARα 設計的 siRNA，同時以 scrambled siRNA 做為 一個負控制。過 24 小時後給予脂締素，再經 6 小時收下細胞並以 RT PCR (A)及西方墨點法 (B)分析。在以 siPPARα 處理的組別中可以看 到：PPARα 的表現量較控制組及以 scrambled siRNA 處理的組別來 得下降；HO-1 及 COX-2 的表現量在沒給予脂締素前均沒有出現一 個明顯的變化。而在給予脂締素後，以 siPPARα 處理的組別中，其 HO-1 及 COX-2 的誘發情形被抑制住；在另外兩組則可以觀察到明
Fig. 10 脂締素增強脂締素增強脂締素增強 脂締素增強 PPARα 和和和 HO-1 及和 及及及 COX-2 啟動子啟動子啟動子啟動子的交互作的交互作的交互作的交互作 用
用 用
用 (以染色質免疫沉澱法分析以染色質免疫沉澱法分析以染色質免疫沉澱法分析)。以染色質免疫沉澱法分析 。。 。
先以 AMPK 抑制劑 Compound C 或 PPARα 抑制劑 GW 6471 對細胞 進行前處理，再給予脂締素。並以 PPARα 促效劑 WY 14643 做為一 個正調控，一小時後收下細胞進行染色質免疫沉澱。在給予脂締素或 促效劑的組別中可以看到有一個明顯的交互作用的情況發生；而在給 予 Compound C 或 GW 6471 的組別中，這個現象則會下降。
(*, P < 0.05 versus ctrl, #, P < 0.05 versus APN-treated group)
Fig. 11 脂締素促進脂締素促進脂締素促進 PPARα 在脂締素促進 在在在 HO-1 及及及及 COX-2 上上上上 PPRE 位置上的位置上的位置上的位置上的 binding (以以以以 EMSA 分析分析分析)分析)))。。。。
先以 AMPK 抑制劑 Compound C 或 PPARα 抑制劑 GW 6471 對細 胞進行前處理，再給予脂締素。並以 PPARα 促效劑 WY 14643 做為 一個正調控，一小時後收下細胞進行 EMSA。在給予脂締素或促效 劑的組別中可以看到明顯的 PPARα 與 PPRE 的 binding 現象；而在 同時給予不同抑制劑的組別中，這個現象則會被抑制住。
Fig. 12 脂締素增加脂締素增加脂締素增加帶脂締素增加帶帶 PPRE 促進子帶 促進子促進子的啟動子促進子的啟動子的啟動子的啟動子活性活性活性活性。。。。
轉染帶 PPRE 促進子的螢光蛋白質體，並在給予脂締素後進行活性測 試；同時轉染空的質體作為控制組。在給予脂締素 6 小時後，透過螢 光的表現可知帶 PPRE 促進子的啟動子活性上升約 90 倍。在轉染空 質體的組別中，加藥後則沒有明顯變化。
(*, P < 0.05 versus ctrl)
Fig. 13 脂締素增加脂締素增加脂締素增加 脂締素增加 HO-1 的的的的啟動子啟動子啟動子活性啟動子活性活性。活性。。 。
轉染帶 HO-1 啟動子的螢光蛋白質體，並在給予脂締素後進行活性測 試，並轉染空的質體當作控制組。在給予脂締素 6 小時後進行螢光活 性測試。透過螢光的表現可知脂締素可增加 HO-1 啟動子的活性約 2 倍；而控制組中則沒有看到螢光表現上升的情形。
(*, p < 0.05 versus PGL 3.10 ctrl, #, P < 0.05 versus APN-treated PGL 3.10)
Fig. 14 脂締素脂締素脂締素透過脂締素透過透過 透過 PPARα 的活化的活化的活化的活化保護細胞防止來自鐵質的傷害保護細胞防止來自鐵質的傷害保護細胞防止來自鐵質的傷害。保護細胞防止來自鐵質的傷害。。。 以 Compound C 及 GW 6471 對細胞進行前處理，再給予脂締素及以 WY 14643 作為正控制；最後給予 iron dextran 刺激，18 小時後收下 細胞以西方墨點法分析。給予脂締素及促效劑的組別可以反轉因鐵刺 激而造成的活化態 caspase 3 上升；同時誘發抗細胞凋亡的蛋白質 Bcl-XL 表現量上升。而在給予不同抑制劑的組別中，原本的保護現 象都被反轉。(*, P < 0.05 vs ctrl, #, P < 0.05 versus iron dextran-treated group, &, P < 0.05 versus APN and iron dextran-treated group)
Fig. 15 HO-1 可保護細胞防止來自鐵可保護細胞防止來自鐵可保護細胞防止來自鐵質所造成的凋亡可保護細胞防止來自鐵質所造成的凋亡質所造成的凋亡。質所造成的凋亡。。 。
先以 HO-1 的抑制劑對細胞前處理，再給予細胞脂締素。最後再給予 iron dextran 刺激，18 小時後收下細胞以西方墨點法分析。在以抑制
先以 HO-1 的抑制劑對細胞前處理，再給予細胞脂締素。最後再給予 iron dextran 刺激，18 小時後收下細胞以西方墨點法分析。在以抑制