實驗結果討論

3.1-1 以化學酵素法合成出 MGE 衍生物(葡萄糖 C6 改為硫醇基)

(1) 6-SH-CNP-Glucose

由於在設計合成路徑時，已參考過多篇文獻，謹慎設計出最易實現的路徑，

故其合成路徑大致和初期所規劃的路徑相同，但仍需透過不斷調整反應物當量 數、反應時間和溶劑等反應條件，來優化反應。

(2)腸菌素

腸菌素的合成已有多篇文獻報導，且都經過優化，按照文獻可以不錯的產率 合成出腸菌素。

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(3)MGE 衍生物(6-SH-Glucose 及腸菌素的結合)

純化出酵素 OleD 及 IroB 後，即可在一鍋內連續利用此兩種酵素合成出 MGE 衍生物，將 6-SH-Glucose 和腸菌素結合，雖然產率看似不高，但透過酵素合成法 能在一鍋的反應中，將修飾過的葡萄糖準確的合成在所希望的位置。

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圖十二、由顏色及 HPLC 監測 OleD 催化反應⁴¹

由上圖可以看到，OleD 可以催化逆轉醣化將 2-chloro-4-nitrophenyl glycosides (CNP-sugars)轉換成 UDP-Glucose。由圖中可以看到當缺乏 OleD 或 UDP 時，溶液 顏色較為澄清；而當反應順利進行，產生 UDP-Glucose 時，可以看到溶液變為黃 色，黃色為2-chloro-4-nitrophenyl 從醣上掉下來後的顏色。從 HPLC 分析中也可以 看到當加有OleD 時，UDP 明顯變少，且產生了大量 UDP-Glucose。

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接著不須純化，直接繼續進行下一步IroB 催化將具有高能的 UDP-Glucose 接 上 Ent，形成 monoglucosylated Ent (MGE)或 diglucosylated Ent (DGE)。由下 圖的 LC/MS 圖可以看出起始物(CNP-sugar 和 Ent)及兩種產物(MGE 和 DGE)。

圖十三、OleD-IroB 酵素反應產物的 LC/MS 圖譜⁴¹

3.1-2 MGE 衍生物連接螢光分子標識出革蘭氏陰性菌

在4-Dimethylaminopyridine(DMAP)的催化下，帶有高活化雙硫鍵的 dansyl 螢光 分子可以與 MGE 衍生物上的硫醇基形成新的雙硫鍵，將螢光分子和 MGE 衍 生物結合，以標識出革蘭氏陰性菌。

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原先我們是計畫可以透過流式細胞儀來觀測細菌被標識的情況，但因為核 心生物實驗室中的流式細胞儀激發dansyl 的雷射光無法使用。因此，我們只好 改以螢光顯微鏡作為觀測。我們以帶有硫醇基的dansyl 分子作為控制組，我們 可以從圖十三中的螢光顯微鏡圖發現，連結螢光分子的 MGE 衍生物被細菌吸 收後產生螢光。然而，只帶有硫醇基的dansyl 分子並沒有被細菌吸收利用，細 菌大多沒有呈現螢光。故我們推斷此 MGE 衍生物應可被革蘭氏陰性菌吸收利 用，用於後續的藥物開發。

圖十四、大腸桿菌 CFT073 螢光顯微鏡圖。上圖以接有螢光分子的 MGE 衍生 物為試劑，下圖則以只帶有硫醇基的螢光分子為控制組。⁴¹

在利用螢光顯微鏡測試的同時，我們也合成出另一種修飾過的螢光分子，

其同樣帶有高能雙硫鍵的Rhodamine。

20

先以化合物 19 為起始物，透過雙硫鍵交換得到化合物 20。

再以 rhodamine B 21 為起始物，和 piperazine 形成醯胺鍵得到化合物 22。接著 與化合物20 再形成醯胺鍵得到化合物 23。實驗室已有合成好的化合物 20 及 22，

故我們只需要一步驟即可得到23 帶有雙硫鍵的 Rhodamine。

最後將化合物16 和化合物 23 以雙硫鍵連接預計可得到化合物 24。該分子即 可利用流式細胞儀來偵測細菌的辨識情況。圖十四中可以看到該分子在不同細菌 中的辨識情形，左圖以22 作為試劑，右圖則以 MGE 衍生物 24 作為試劑。我們可 以發現帶有螢光分子的 MGE 衍生物可以標識出革蘭氏陰性菌(大腸桿菌 CFT073 及BL21)，因此細菌的螢光強度增加，其螢光波峰整體右移，大約增加一個數量級。

反之，革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)則無此現象。因此我們認為此 MGE 衍生物 能夠選擇性地將藥物送入革蘭氏陰性菌中。

21

圖十五、以接上Rhodamine 的 MGE 衍生物標示不同細菌。在不同菌中分別以帶有 linker 的 Rhodamine 化合物 22 作為試劑(左圖)和接上 Rhodamine 的 MGE 衍生物 24 作為試劑(右圖)。

22

23

圖十六、綠色螢光蛋白在不同試劑加入下的螢光表現

24

因此我們決定直接接上能夠阻止必須蛋白質轉譯的嗎啉基，我們在參考文獻後，選 用能夠阻止DNA 旋轉酶轉譯的基因³⁵，便能直接達到抑菌的效果。同樣由genetool 公 司 合 成 出 尾 端 以 雙 硫 鍵 修 飾 的 嗎 啉 基 分 子 ， 其 序 列 為 5'-GTTAC-CCTGACCGACCA-3’。

3.1-3 (2) MGE 衍生物連接使細胞質膜去極化的大腸菌素 C 端胜肽鏈

向陳建華教授順利取得菌種後，我們將其質體抽出，並透過聚合酶連鎖反應及 重組DNA 技術，再經蛋白表達及純化得到具有細胞毒性的 C 端大腸菌素 Ib(化合 物26) (見圖十七)，且於 clone 時在此端胜肽鏈上加上具硫醇鍵的半胱胺酸，再接 上2,2'-二硫二吡啶得到具高能雙硫鍵的化合物 27。

圖十七、C 端大腸菌素 Ib 蛋白質(MW=26018)純化 SDS-PAGE 膠圖和基因片段的 PCR 擴增。(T:total lysate; P: pellet fraction; S: supernatant fraction; FT: flow through;

W4: wash fraction 3; E3-E4: elution fractions.)。

25

原先我們預期具高能雙硫鍵的化合物 27 可以和 MGE 衍生物(化合物 18)連接 得到新型抗生素，但在進行雙硫鍵反應時，我們以液相色譜法-質譜聯用監測反應 時只有看到 m/z=957 的訊號，並沒有看到預期的產物。(見圖十八)我們推斷 m/z=957 為帶有吡啶的高能雙硫鍵轉移到腸菌素的訊號，而之所以會產生此產物的原因應 該是胜肽鏈上原本修飾上2,2'-二硫二吡啶之處為一段α螺旋結構，故其立體障礙太 大，無法接上MGE 衍生物。之後我們除了在 C 端大腸菌素 Ib 加上半胱胺酸外，

再加上幾個無結構的胺基酸作為連接，降低蛋白結構的立體障礙，改進反應。

圖十八、化合物27 和化合物 18 雙硫鍵反應後產物質譜儀及推斷產物。

3.2 後續實驗及應用

1. 以化合物 25 作為試劑進行生物測試，將化合物 25 在限鐵環境中加入，再 將菌液塗於含有培養基的盤中，待菌落生成，再計算菌落形成數。藉由計 算菌落形成單位（CFU，colony-forming unit）的方式來觀測接有嗎啉基的 MGE 衍生物其抑菌效果，並預期能夠看到該分子抑制細菌生長，相較於 未加入化合物25 形成較少的菌落。接著，再將化合物 25 對不同菌種進行 同樣的實驗，觀察其是否對革蘭氏陰性菌具有選擇性，我們預期化合物25 只會抑制革蘭氏陰性菌的生長，革蘭氏陽性菌並不會受到該分子的影響。

26 螢光分子 dansyl 部分已和實驗室成員李昱賢合作發表於文章” Facile and Versatile Chemoenzymatic Synthesis of Enterobactin Analogues and Applications in Bacterial Detection.”之中，於 2016 年九月刊登於 Angewandte Chemie International Edition。

41

27 新鮮的2YT培養基以1:100稀釋，在生長到OD600 0.6~0.8.時，加入異丙基-β-D-硫代 半乳糖苷 (IPTG) (最終濃度0.4 mM)，接著該菌液在18⁰C，200rpm下培養一個晚上。

在4⁰C下以3500 rpm離心得細菌，以细胞裂解液A (Lysis buffer A (10 mM 咪唑、20 鮮的2YT培養基以1:100稀釋，在生長到OD600 0.6~0.8.時，加入異丙基-β-D-硫代半 乳糖苷 (IPTG) (最終濃度0.1mM)，接著該菌液在18⁰C，200rpm下培養一個晚上。

在4⁰C下以3500 rpm離心得細菌，以细胞裂解液B (Lysis buffer B (10 mM 咪唑、20

28 EcoRI 切開，再以 Antarctic Phosphatase 將切除的 pET28a 去磷酸化， 再以 T4 ligase 將切除過的聚合酶連鎖反應產物和去磷酸化的 pET28a 質體黏合。黏合後的產物再 轉形於 DH5α，並送定序確認結果。

(2)蛋白表達及純化

將已經cloning好的pET28a-colicinIb-His6轉型於 BL21(DE3) 表達細菌,該菌在37⁰C 下於加有卡那霉素(50μg/mL)的LB培養基培育一個晚上。該菌液再以新鮮的LB培養 基以1:100稀釋，在生長到OD600 0.6~0.8.時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) (最終濃度0.1mM)，接著該菌液在18⁰C，200rpm下培養一個晚上。在4⁰C下以3500 rpm離心得細菌，以细胞裂解液C (Lysis buffer C (20 mM 三羥甲基氨基甲烷 pH 8、

500 mM 氯化鈉)使其再懸浮，接著以超音波破菌。透過在4⁰C，以12,000 rpm離心 45分鐘將細胞殘骸移除。懸浮液則與Ni-nitrilotriacetate在4⁰C反應1小時。將該液體 配置於管柱，以細胞裂解液C清洗，再以梯度沖提液C(elution buffer B (50-250 mM 咪唑、20 mM 三羟甲基氨基甲烷 pH 8, 25 mM 氯化鉀、2mM TCEP、30%甘油)洗 提，洗提出含有大腸菌素Ib的部分，以儲存溶液C(20 mM 三羥甲基氨基甲烷 pH 8, 500 mM 氯化鈉)流PD-10去鹽管柱，得到化合物26。

三、有機合成的一般性方法：

所有反應試劑皆為試劑級，並在沒有進一步純化的情況下使用。無水二氯甲烷、

無水二甲基甲醯胺皆是取自solvent system。薄層層析使用 Merck 公司的 F254 矽膠 片。化合物利用紫外線燈、磷鉬酸酒精，來偵測或顯色。管柱層析矽膠使用Merck 公司的Geduran Si 60 矽膠粒。所有對濕氣、氧氣敏感的實驗在氮氣環境下進行。

核 磁 共 振 光 譜 使 用 Varian 公 司 的 Unity Plus-400 (400HMz) 或 Bruker 的

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AVIII(500MHz) 測得。化學位移(δ)以百萬分之一(ppm)為單位紀錄，偶合常數 (coupling constant)則以赫茲(Hz)為單位紀錄。所有高效液相層析實驗都是以 Waters 1525 binary pump machineh、Agilent 1260 infinity Quaternary LC 操作進行。 所有液 相色譜法-質譜聯用數據都是由 Agilent 1260 infinity Quaternary LC 聯用 Bruker

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 145.11; 132.85; 130.02; 128.13; 99.51; 74.22; 71.90;

69.68; 69.55; 69.35; 55.53; 21.79.

30

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 170.16; 169.52; 169.25; 168.59; 145.17; 132.33; 129.83;

128.04; 91.47; 88.60; 69.53; 68.89; 67.99; 67.10; 21.60; 20.76; 20.56; 20.43; 20.36

.

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 194.84, 170.46, 169.90, 169.88, 169.04, 89.14, 70.89, 70.09, 69.99, 69.43, 30.64, 29.87, 21.10, 20.89, 20.67.

化合物5 的合成：秤取化合物 4(0.45g)於 50mL 圓底瓶中，在冰浴中以醋酸(0.9mL) 溶解之，攪拌至全溶。溴酸(2mL)於攪拌下緩慢加入，在室溫中反應 15 小時後，再 加溴酸(2mL)，再於室溫中反應兩小時，以二氯甲烷稀釋，再以碳酸氫鈉中和，再 以蒸餾水/二氯甲烷萃取產物，水層以二氯甲烷萃取二次，合併有機層後再以蒸餾

31

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 194.14; 170.03; 169.63; 168.99; 157.25; 143.24; 126.11;

124.93; 123.63; 116.67; 99.32; 74.17; 72.00; 70.57 ; 70.43; 30.45; 30.07; 20.61; 20.54;

20.53.

32

99.82; 76.73; 76.16; 73.03; 71.72; 25.66

(2)腸菌素(腸菌素之合成方法參照文獻報導^14-15。)

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化分子篩的添加漏斗和圓底瓶相接，加熱迴流一天，以旋轉濃縮儀抽乾，再以加壓 管柱層析法(二氯甲烷：正己烷=1：1)分離純化，是為化合物 12；產率 68%

化合物13 的合成：秤取化合物 12(0.58g)於 50mL 圓底瓶中，以乙醇(4.35mL)溶解 之，攪拌至全溶。再於攪拌下緩慢加入鹽酸/ 1,4-環氧己烷 (0.55mL)，加熱迴流一 個晚上，以乙醇洗抽濾，是為化合物13；產率：Quantitative

化合物14 的合成：秤取化合物 13(0.25g)於 50mL 圓底瓶中，以二氯甲烷(16mL)溶 解之，再秤取 N,N-二異丙基乙基胺(1.02g)攪拌至全溶。同時秤取 2,3-苯甲氧基-苯 甲 酸(1.02g) 於 另 一 100mL 圓 底 瓶 中 ， 以 二 氯 甲 烷 (28mL) 溶 解 之 ， 再 秤 取 PyBOP(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate)(1.89g) 一起攪拌。半小時後，將兩個圓底瓶混在一起，於室溫攪拌一個晚上，以旋轉濃縮 儀抽乾，再以加壓管柱層析法(二氯甲烷：甲醇=100：1)分離純化，是為化合物 14：

產率74%

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化合物15 的合成：秤取化合物 13(0.23g)於 50mL 圓底瓶中，以乙醇(5.71mL)和乙 酸乙酯(6.64mL)溶解之，攪拌至全溶。再於攪拌下加入鈀碳催化劑(0.07g)，將圓底 瓶放入高壓反應器，加入5 bar 氫氣，於室溫下攪拌反應一個晚上，再以濾紙過濾，

是為化合物15；產率：77%

化合物15

1H-NMR (400 MHz, Acetone-d6): δ 8.48 (d, 3H, J = 7.1 Hz, amide-NH); 7.24 (d, 3H, J

= 8.1 Hz, Ar-H6); 7.02 (d, 3H, J = 7.9 Hz, Ar-H4); 6.73 (t, 3H, J = 8.0 Hz, Ar-H5); 5.11 (m, 3H, Serine-Hβ); 4.73 (d, 6H, J = 4.6Hz, Serine-Hα).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 170.86 (NHC=O); 169.85 (OC=O); 150.22 (Ar-C2);

147.13 (Ar-C3); 120.00 (Ar-C4); 119.61 (Ar-C6); 118.39 (Ar-C5); 115.16 (Ar-C1);

65.46(Serine-Cβ); 53.24 (Serine-Cα).

HRMS (ESI+): calculated for [M+H]+, 670.1515; found, 670.1524.

35

36

13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ 170.75, 170.70, 170.67, 170.54 (C=O); 149.54 (Ar-C2); 149.27 (Ar-C2); 147.23, 147.21 (Ar-C3); 147.10 C3); 131.48 (Glc-Ar-C5); 120.09, 120.06, 120.04, 119.77, 119.71, 119.57, 119.27 (Ar-C4 & Ar-C5 & Ar-C6 &

Glc-Ar-C4 & Glc-Ar-C6); 116.81, 116.77 (Ar-C1); 116.48 (Glc-Ar-C1); 83.06, 81.69, 79.42, 76.31 (Glc-C1~C5); 65.89, 65.84 (Serine-Cβ); 53.74, 53.69, 53.51 (Serine-Cα);

27.12 (Glc-C6)

化合物16：HRMS (ESI+): calculated for [M+H]+, 848.18; found, 848.2.

化合物17 的合成：225 μL 的 Dansyl-PDS (10mM 溶於二甲基亞碸)、225 μL 的化 合物16 (10mM 溶於二甲基亞碸)和 22.5 μL4-二甲氨基吡啶(100mM 溶於二甲基亞 碸)加在一起，於 37⁰C 下反應一個晚上，以真空離心機移除溶劑。剩餘的固體以 DMSO/H2O=1:1 溶解。以高效液相層析儀純化分離。純化時使用 10%-80%乙腈水 溶液加0.1%三氟乙酸的梯度來做為沖提液。是為化合物 17，產率 69%

化合物17 的合成：225 μL 的 Dansyl-PDS (10mM 溶於二甲基亞碸)、225 μL 的化 合物16 (10mM 溶於二甲基亞碸)和 22.5 μL4-二甲氨基吡啶(100mM 溶於二甲基亞 碸)加在一起，於 37⁰C 下反應一個晚上，以真空離心機移除溶劑。剩餘的固體以 DMSO/H2O=1:1 溶解。以高效液相層析儀純化分離。純化時使用 10%-80%乙腈水 溶液加0.1%三氟乙酸的梯度來做為沖提液。是為化合物 17，產率 69%