5-1 超音波穿透培養皿之聲功率量測結果
在過去的研究中發現，聲功率是超音波刺激細胞中常改變的參數之一，
但鮮少研究探討超音波穿透培養皿後作用於細胞上的實際功率，為此本實 驗針對超音波穿透培養皿之聲功率變化量進行探討。聲功率量測採用頻率 為 1 MHz 且直徑為 5 公分的超音波換能器，並將超音波換能器固定於壓 克力模具中；在培養皿的部分則使用透明板，此透明板源自於 75T flask 之底部，取其約6 公分 × 6 公分的正方形大小，厚度為 1.5 公厘。聲功率 量測之實驗裝置圖與第 4-6-4 節的聲功率量測系統相同。而培養皿擺設之 位置如圖 5-1 所示，由於標靶必須盡量靠近透明板，以符合細胞受到超音 波刺激之情形，因此，換能器表面與標靶之間的距離設定為 1.3 公分。
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(a)無培養皿 (b)有培養皿
圖5-1 培養皿之擺設位置
聲功率量測結果如圖 5-2 所示，先選擇四個固定之聲功率，分別為 145 mW、304.5 mW、449.5 mW 與 594.5 mW，並將這四種不同功率設定為超 音波穿透培養皿時的聲功率。紀錄此四種功率的電壓值，分別為5.9 V、
7.4 V、9.3 V 和 11.6 V，之後，利用這些電壓來驅動超音波刺激器，並量 測超音波在無培養皿時的聲功率大小，此時可以發現超音波在無培養皿時 的聲功率較有培養皿的時候大一些，但並不會差異很大，其差異程度可由 表 5-1 所示，此表顯示超音波穿透培養皿之聲功率損耗率，由於損耗之聲 功率皆在 3 %以下，因此可以推斷培養皿對於本實驗所需之聲功率影響不 大。
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59
5-2 超音波刺激細胞之結果
5-2-1 大鼠骨髓間質幹細胞之培養與鑑定分析
在進行細胞刺激實驗前，會先進行間質幹細胞的培養與鑑定分析，
以確認其純度。由於間質幹細胞是從Sprague-Dawley 大鼠之骨髓取出，
但骨髓中的幹細胞繁多，因此必須要分離出間質幹細胞，其分離方式 是利用間質幹細胞具有貼附之特性，使得無法貼附於培養皿的造血幹 細胞會被移除。待間質幹細胞培養至第二代時，再藉由光學顯微鏡來 觀察細胞形態，可看出間質幹細胞是呈現長梭形或多角形的形態，如 圖 5-3 所示。
圖 5-3 間質幹細胞之細胞形態圖 (scale bar：200μm)
在鑑定分析方面，本實驗利用流式細胞儀來分析萃取之細胞是否 為間質幹細胞，間質幹細胞會表現的表面抗原為 CD44、CD73、CD90 和 CD105 等，但並不表現造血幹細胞之表面抗原，如 CD14、CD34、
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CD45。實驗中使用 CD34、CD90 抗體用來標識間質幹細胞的表面抗 原，由分析結果顯示，在 10000 顆細胞中，CD90 抗體標識出的表面 抗原所佔比例約為 97.48 % %左右，而 CD34 抗體並無表現，如圖 5-4 所示。因此，本實驗所萃取的間質幹細胞經流式細胞儀分析為高純度 的間質幹細胞。
(a) CD90 (b) CD34
圖 5-4 間質幹細胞於流式細胞儀之鑑定分析
本實驗在進行細胞刺激實驗前，會先將間質幹細胞進行貼附培養 2 天，這種方式可以盡量避免細胞在尚未貼附完全時，就受到超音波的 刺激而無法貼附生長。圖 5-5 為間質幹細胞經五氮胞苷誘導後第 1 天 與第 3 天的細胞型態，從圖中可以發現在第一天的時候，細胞數目較 少，且細胞呈長梭形或多角形的形態，當細胞經過兩天的貼附培養，
細胞的平均面積較第一天來的大，且細胞數目也較多。
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(a)第 1 天 (b) 第 3 天
圖5-5 間質幹細胞經五氮胞苷誘導後第 1 天與第 3 天的細胞型態
5-2-2 不同聲功率的連續超音波對細胞刺激之結果
本實驗使用頻率1 MHz 和不同聲功率(145 mW、304.5 mW 和 449.5 mW) 的連續超音波(工作週期 100%)來進行細胞刺激，刺激時間為 10 分鐘，持續 12 天，再以光學顯微鏡觀察且拍攝細胞於第 7 天與第 14 天時的型態變化，並對其細胞增生量及分化程度進行統計分析。
圖 5-6 為間質幹細胞經不同聲功率的連續超音波刺激後第 7 天的 細胞型態圖。圖 5-6 (a)為未經超音波照射的控制組，圖 5-6 (b)-(d)則為 細胞經超音波照射的刺激組，其聲功率分別為145 mW、304.5 mW 和 449.5 mW。從圖中發現間質幹細胞在第 7 天時的細胞體積皆有明顯增 大，且間質幹細胞的尾足較為延展，呈現長梭形的型態。
200μm 200μm
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圖5-7 為間質幹細胞經不同聲功率的連續超音波刺激後第 14 天的 細胞型態圖。圖 5-7 (a)為未經超音波照射的控制組，而圖 5-7 (b)-(d) 為細胞經超音波照射的刺激組，其聲功率分別為 145 mW、304.5 mW 和 449.5 mW。從圖中發現在第 14 天時細胞有聚集生長之情形，細胞 之型態呈現長梭形，且排列方向趨於一致。
(a)控制組 (b)刺激組-145 mW
(c) 刺激組-304.5 mW (d) 刺激組-449.5 mW
圖 5-6 間質幹細胞經不同聲功率的連續超音波刺激後第 7 天的細胞型 態圖
100μm 100μm
100μm 100μm
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(a)控制組 (b)刺激組-145 mW
(c) 刺激組-304.5 mW (d) 刺激組-449.5 mW
圖5-7 間質幹細胞經不同聲功率的連續超音波刺激後第 14 天的細胞型 態圖
50μm 50μm
50μm 50μm
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圖 5-8 為間質幹細胞經不同聲功率的連續超音波刺激後第 7 天與 第 14 天的細胞增生圖。在第 7 天的刺激組 (145mW、304.5mW、
449.5mW) 與控制組相比分別減少約 37%、32%與 5%，而在第 14 天 的刺激組 (145mW、304.5mW、449.5mW) 與控制組相比分別減少約 32%、21%與 12%。從上述之比較可發現連續超音波會造成細胞數目 的減少。但對於較高聲功率的超音波而言卻僅有少量的細胞減少，可 能原因為聲功率 449.5mW 的刺激組相較於其他兩組來說有較好的細 胞增生效果。
圖 5-8 間質幹細胞經不同聲功率的連續超音波刺激後第 7 天與第 14 天的 細胞增生圖
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圖 5-9 為間質幹細胞經不同聲功率的連續超音波刺激後於流式細胞儀 分析第 7 天與第 14 天之心肌蛋白(α- actinin)比例。此分析方式是利用流式 細胞儀來量化出間質幹細胞分化成心肌細胞之比例，以分析心肌特異性蛋 白 α- actinin 之蛋白表現量。而螢光相對值則顯示於圖 5-10，此值代表間 質幹細胞分化成心肌細胞的分化程度，在第 7 天的刺激組 (145mW、
304.5mW、449.5mW) 與控制組相比約增長 2.8 %、5.6 %與 5.3 %，而在 第 14 天的刺激組 (145mW、304.5mW、449.5mW) 與控制組相比約增長 -2.2 %、2.4 %與 -5.4%。因此，經過上述之比較可發現，刺激組於第 7 天 之分化率略優於控制組，但並無統計上之差異(P>0.05)；而在第 14 天中，
僅有聲功率 304.5mW 的分化率略優於控制組，但並無統計上之差異 (P>0.05)，其他兩組刺激組 (145mW 與 449.5mW)的細胞分化率較控制組 差，亦無統計上之差異 (P>0.05)。另外，刺激組(145mW 與 304.5mW)與 控制組於第 14 天之分化率較第 7 天為顯著 (P<0.05)。
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(a)控制組-D0 (b)控制組- D7) (c)控制組- D14
(d)刺激組- D7-145 mW
(e) 刺激組- D7-304.5 mW
(f) 刺激組- D7-449.5 mW
(g) 刺激組- D14-145 mW
(h) 刺激組- D14-304.5 mW
(i) 刺激組- D14-449.5 mW 圖 5-9 不同聲功率的連續超音波刺激間質幹細胞分化後經流式細胞儀 分析的心肌特異性蛋白表現圖
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圖 5-10 連續超音波刺激間質幹細胞分化後經流式細胞儀分析心肌特異性 蛋白的螢光相對值 (*.p<0.05)
5-2-3 不同聲功率的脈衝超音波對細胞刺激之結果
實驗使用頻率 1 MHz 和不同聲功率 (145 mW、304.5 mW 和 449.5 mW) 的脈衝超音波 (工作週期 20%)來進行細胞刺激，刺激時間為 10 分鐘，持續 12 天，再以光學顯微鏡觀察且拍攝細胞於第 7 天與第 14 天時的型態變化，並對細胞的增生量及分化率進行統計分析。
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圖 5-11 為間質幹細胞經不同聲功率的脈衝超音波刺激後第 7 天的 細胞型態圖。圖5-11(a)為未經超音波照射的控制組，圖 5-11 (b)-(d)則 為間質幹細胞經超音波照射的刺激組，其聲功率分別為145 mW、304.5 mW 和 449.5 mW。從圖中觀察到間質幹細胞之細胞型態與連續超音波 之第 7 天相似，細胞的體積以及細胞核皆有明顯增大，且間質幹細胞 的尾足較為延展，呈現長梭形。
圖 5-12 為間質幹細胞經不同聲功率的脈衝超音波刺激後第 14 天 的細胞型態圖。圖5-12 (a)為未經超音波照射的控制組，而圖 5-12 (b)-(d) 為細胞經超音波照射的刺激組，其聲功率分別為 145 mW 、 304.5 mW 和 449.5 mW 。從圖中觀察到細胞在第 14 天時有聚集生長的情形，
當細胞密度逐漸增加時，分化之細胞會逐漸拉長，且在彼此之上層生 長而形成團塊，而這些細胞團塊的排列方向則趨近於一致。
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(a)控制組 (b)刺激組-145 mW
(c) 刺激組-304.5 mW (d) 刺激組-449.5 mW
圖 5-11 間質幹細胞經不同聲功率的脈衝超音波刺激後第 7 天的細胞型 態圖
100μm 100μm
100μm 100μm
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(a)控制組 (b)刺激組-145 mW
(c) 刺激組-304.5 mW (d) 刺激組-449.5 mW
圖 5-12 間質幹細胞經不同聲功率的脈衝超音波刺激後第 14 天的細胞 型態圖
50μm 50μm
50μm 50μm
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圖 5-13 為間質幹細胞經不同聲功率的脈衝超音波刺激後第 7 天 與第 14 天之細胞增生圖。在第 7 天的刺激組與控制組相比分別約增 長 6 %、10%與 20%，而在第 14 天的刺激組與控制組相比分別約增 長 8%、12%與 39%。從上述之比較可發現脈衝超音波會使得細胞數 目的增長，尤其是聲功率 449.5mW 的刺激組在第 14 天的細胞增生 量最為明顯，而且聲功率 449.5mW 的刺激組在第 14 天的細胞數量 較第 7 天為顯著，且具有統計上之差異 (P<0.01)。
圖5-13 間質幹細胞經不同聲功率的脈衝超音波刺激後第 7 天與第 14 天的 細胞增生圖 (**P<0.01)
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圖5-14 為間質幹細胞經不同聲功率的脈衝超音波刺激後於流式細 胞儀分析第 7 天與第 14 天之心肌蛋白(α- actinin)比例。此分析方式是 利用流式細胞儀來量化出間質幹細胞分化成心肌細胞之比例，以分析 心肌特異性蛋白 α- actinin 之蛋白表現量。而圖 5-14 之螢光相對值則 顯示於圖 5-15。在第 7 天的刺激組(145mW、304.5mW、449.5mW)與 控制組相比約增長 13.2 %、13.4 %與 9.2 %，其中刺激組(145mW、
304.5mW)與控制組具有統計上之差異(P<0.05)。而在第 14 天的刺激組 (145mW、304.5mW、449.5mW)與控制組相比約增長 6.9%、7.4%與 5.6%，
此三組刺激組之細胞分化率皆略優於控制組，但不具有統計上之差異 (P>0.05)。另外，這三種刺激組於第 14 天的細胞分化率較第 7 天為顯 著 (P<0.05)。
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(a)控制組 D0 (b)控制組 D7 (c)控制組 D14
(d)刺激組- D7-145 mW
(e) 刺激組- D7-304.5 mW
(f) 刺激組- D7-449.5 mW
(g) 刺激組- D14-145 mW
(h) 刺激組- D14-304.5 mW
(i) 刺激組- D14-449.5 mW 圖 5-14 不同聲功率的脈衝超音波刺激細胞分化後經流式細胞儀分析的 心肌特異性蛋白表現圖
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圖 5-15 脈衝超音波刺激細胞分化後經流式細胞儀分析心肌特異性蛋白的 螢光相對值 (*.P<0.05)
5-2-4 連續超音波與脈衝超音波之結果比較
綜合上述之結果，發現連續超音波與脈衝超音波對於間質幹細胞 之細胞增生與分化皆有影響。在細胞增生方面，連續超音波(工作週期 100%)與脈衝超音波 (工作週期 20%) 於第 7 天和第 14 天之細胞數比 較圖，分別如圖 5-16、圖 5-17 所示，從圖中發現細胞經過連續超音波 刺激後，其細胞數量皆略微減少，而細胞經過脈衝超音波刺激後的細
綜合上述之結果，發現連續超音波與脈衝超音波對於間質幹細胞 之細胞增生與分化皆有影響。在細胞增生方面，連續超音波(工作週期 100%)與脈衝超音波 (工作週期 20%) 於第 7 天和第 14 天之細胞數比 較圖，分別如圖 5-16、圖 5-17 所示，從圖中發現細胞經過連續超音波 刺激後，其細胞數量皆略微減少，而細胞經過脈衝超音波刺激後的細