實驗結果 - Mn,Zn-MTGFP融合蛋白磁性與結構分析

4-1. 磁性蛋白制備方法及結果

破菌後所取得inclusion body 以及 supernatant 先利用 SDS-PAGE 來看我們所需

要的樣品的MT-GFP 會存在哪裡，由此 SDS-PAGE 我們可以明顯看到 MT-GFP 存在

於內涵體(inclusion body)以及上清(supernatant)(圖 21 MT-GFP 分子量為 39KDa )，由

於由Supernatant 純化出 MT-GFP 比從 inclusion body 純化出 MT-GFP 來的方便且容

易因此我們選擇Supernatant 來通 His-Tag Column 進行純化。內涵體是一種不可溶、

密度較大、顆粒狀的無活性蛋白質[96]，內涵體不一定只在受損、突變、生長溫度偏

高才會出現在細胞內，當表現蛋白質為有毒蛋白或微生物在細胞內大量表現重組蛋

白質時，也會在其內形成不可溶的蛋白質堆積，即為內涵體[96-97]。但一般來說必

須將破菌後的內涵體，經過離心、重複洗滌、膜過濾等方式[96-97]才可以純化出我

們所要的蛋白。但是若是使用上清液的話，只需經過Hia-tag Column，來純化便可以

得到我們所要的蛋白，相較於內涵體而言較為方便，另一方面對於初學者也較容易

進行實驗。

經過His-Tag Column 進行純化而得到的 MT-GFP 蛋白質後，先利用 SDS-PAGE

分別將每次Elute(E1~E4)的 MT-GFP 來確認是否成功純化 MT-GFP(圖 20 MT-GFP 分

子量為39KDa )，可以從此 SDS-PAGE 上看出在第二次以及第三次 Elute 時 MT-GFP

才會被純化下來，因此我們選用量較大的第二次Elute 的 MT-GFP 做為樣品(圖 22(a))。

接著再利用1 倍 PBS 緩衝液將濃度調整至 10μM ，取出 300μl 後，加入 2μl HCl

將PH 值降至 2 使蛋白質結構打開，並吹氮氣使環境保持在無氧狀態。再分別加入金

屬離子，此時需注意，因為 Zn²^＋的活性大於Ｍn²^＋所以必須先加入含有Ｍn²^＋的醋酸

錳後（100mM 醋酸錳取 2μl），才可以加入含 Zn²^＋的氯化鋅（9mM 氯化鋅取 4.5

μl），最後加入 PBS 將 pH 值回復至 pH7 附近使蛋白結構會復正常，此時蛋白質變

帶有金屬離子，在內部形成 zinc-blende 的結構，樣品完成會如下圖 22(b)，若是有

沉澱物稀出，則代表加入的金屬量過多，但可以利用強磁鐵測試看看成沉澱物是否

具有磁性。

圖21 MT-GFP 之 SDS-PAGE 分析利用 12% SDS-PAGE 確定蛋白質利用 His-Tag Column 純化後 MT-GFP 的純度。M 代表 Marker, I 代表內涵體、S 代表上清液，S+I 代表內涵體＋上清液，I*代表未加入 IPTG 之內涵體、S*代表未加入 IPTG 之上清液，S+I *代表未加入 IPTG 之上內涵體＋上清液，E1-E3 為不同次數Elute 所得到的樣品，紅色標的的位置為 MT-GFP 蛋白質。

圖22 MT-GFP 以及置換金屬後 Mn,Zn-MT-GFP 圖(a)為經過 His-Tag Column 進行純化而得到的 MT-GFP 蛋白質圖(b)是將 MT-GFP 置換金屬離子後的結果，此圖為金屬加過量導致沉澱的結果

(a) (b)

本實驗所使用的MT-GFP 也使用西方墨點法來確認 MT-GFP 蛋白質，此實驗是

請本實驗室博士班朱學亮學長幫忙，利用西方墨點法來確認MT-GFP 蛋白質，結果

如圖23 所示。MT-GFP 蛋白質為融合蛋白，在其 N 端具有 6 個 Histidine 的序列，

其次連接MT 蛋白質分子、最後才是 GFP 蛋白質分子，知道這些序列後，選用專一

性抗體 rabbit–anti-MT、Mouse-anti–His 以及 Mouse-anti–GFP 來辨認特定序列，證明

此為蛋白質為MT-GFP 融合蛋白質[50]。其方法為將待驗證的蛋白質 MT-GFP 經由

SDS-PAGE 後將蛋白質轉印到 PVDF 上，接著先使用一級抗體 rabbit–anti-MT、

Mouse-anti–His、Mouse-anti– GFP 進行反應，再使用二級抗體：Goat-anti-mouse 及

Goat-anti-rabbit ，最後再加入 HRP 的受質在 membrane 上進行呈色。結果如圖 23 所

示，若是待測蛋白質可以被此3 種抗體辨視，且與 SDS PAGE 位置吻合，則此待測

蛋白質就可以被證實為MT-GFP 融合蛋白[50]。

圖23 MT-GFP Western 的結果 MT-GFP 經由 SDS-PAGE 後將蛋白質轉印到 PVDF 上，先分別使用一級抗體rabbit–anti-MT 、Mouse-anti–His、Mouse-anti– GFP 進行反應，再使用二級抗體：

Goat-anti-mouse 及 Goat-anti-rabbit ，最後再加入 HRP 的受質在 membrane 上進行呈色。紅色為 MTGFP，白色為 GFP，紫色為 MT，PET200-PGB1 為 non specific 此處用來作為 Control。

本實驗所使用的MT-GFP 在先前的研究中就已經有做過蛋白質定序來確認此蛋

白質為MT-GFP，其定序結果如下表 1[50]：

表1 為 MTGFP protein 定序結果紅色背景文字為 His tag 蛋白質序列(HHHHHH)、黃色背景的文字為MT 蛋白質序列(MDPNC…SCCA)以及綠色背景的文字為 GFP 蛋白質序列(MASKG…DELYK)

MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDHPFTMDPNCSCATDGSCSCA

GSCKCKECKCTTCKKSCCSCCPVGCAKCSRGCVCKEASDKCSCCAKGQFCRYPA

QWRPLESRMASKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLK

FICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISF

KDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITAD

KQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKD

PNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK-

200 300 400 500 600 700 800

若是希望實驗取得的光譜可以更加準確以及減少雷射照射時間，可以進行收光

處(圖 25)的校正，此處的校正較為精密且複雜，所以在校正前請先縮短矽片取光譜

的時間，從 30 秒鐘開始取光譜一次，再變更時間為 20 秒、10 秒、3 秒、最後為 1

秒，在其間觀察矽片訊號的變化，一般來說，隨著時間縮短，訊號會成比例的下降，

若是在3 秒鐘還可以清楚的分辨出矽片訊號的位置，那便可以進行實驗，若是 3 秒

鐘無法辨識，才進行校正。

圖25 拉曼光譜儀訊號接收處

校正步驟，先將矽片取下，將汞燈放上樣品台，並將汞燈出光處對準物鏡，因

為汞燈的訊號較強也較準確因此校正收光處時利用汞燈可以有效的縮短校正所花的

時間。將收光時間改為0.1 秒，另外利用軟體將予測波長改為以及 546.07 nm 並將Ｘ

軸單位改為 Wavelangth (nm)，調整將”Shutter”開啟，如此一來儀器便會在不關閉

Shutter 的狀況下不斷的取光譜，這樣便可以一邊調整後端收光處的光纖位置、物鏡

位置一邊觀察及時光譜訊號的改變情況，校正只要進行到可以取的汞燈光譜之最大

值即可，最後將Shutter 關閉，再換回矽片以及將單位換回 Raman Shit (cm^-1)再次進

行矽片的量測及校正便可以量測樣品。

將分別將MT-GFP 以及磁性蛋白 Mn,Zn-MT-GFP 利用拉曼光譜儀分析其光譜特

性，可以初步的確認是否與我們所假設的結構相互附符合(圖 26)。

經實驗後發現兩者在光譜上有所差異(圖 27、表 1)，經由查閱文獻後得知，若是

錳離子與硫有相接的話，會在350 Raman Shit (cm^-1)處會有拉曼訊號的產生（如圖 27

示），若是金屬含量較高會使得此訊號的半高寬變寬，以及這附近多出較平滑的訊

號（如圖27 示），此訊號是因錳離子與硫互相鍵結並形成 bending mode 所產生[98]，

如次一來便可以證明此實驗方法確實有將錳至入到MT-GFP 蛋白質中，而 MT-GFP

蛋白質中只有Cys 上磁有硫，因此也間接說明了錳是藉由 Cys 與 MT-GFP 蛋白質相

互合。另外我們也在光譜中發現鋅與硫原子鍵結的訊號如圖26 以及表 1 所示。

圖26 Mn,Zn-MT-GFP 理想結構示意圖

288cm

^-1

355cm

^-1

In te n sit y (  10

A rb .u n it )

4-3 超導量子干涉磁量儀磁性分析

(Super-conducting Quantum Interference Device magnetometer (SQUID))

超導量子干涉元件 (Superconducting Quantum Interference Device,簡稱 SQUID)

是目前所知最敏感的磁通偵測器，其獨特的磁通與電壓的週期特性，使得SQUID 已

圖28 SQUID 裝置樣品示意圖

圖 29 (a)樣品輸送室 (b)樣品裝入樣品輸送室示意圖

(a) (b)

樣品

樣品輸送室

樣品進入儀器後，先利用軟體找尋樣品的位置，進入軟體後先選擇軟體中的”

center”並選擇為使用直流電模式”DC“後，按照順序點選軟體中的選項操作即可，

第一選項為先將步進馬達歸零，再使用第二個選項設定掃描量測的吸管長度範圍，

一般建議質設定為6 cm，表示以樣品為中心，上下各可移動的距離為 3 cm，掃描點

數一般設定為33 個點。接著在軟體中設定量測中心位置所需要的外加場的大小，一

般而言由小磁場慢慢的向上加，所以從500 O.e 開始做起。設定完成後等磁場穩定，

便可以使用第三個選項進行粗略的掃描樣品中心位置，此時會出現一個量測圖形，

若是圖形有極大及小值，那代表此樣品初步判斷為有具有磁性的物質，若是為極大

值，代表為順磁性物質，若是為極小值則為逆磁性物質。緊接著先使用第五個選項

試著將量測出來的圖形以及儀器自動 fitting 的調整至最接近，最後則是用第四個選

項正式完成量測樣品位置。

等到儀器抓到樣品位置後，先確認設定量測的條件是否正確，此實驗中設定的

條件為，外加場為3T，量測溫度為 300K 以及 10K，確認完畢後及可以開始進行量

測，每次量測一個溫度得磁性時間約為7 個小時。

實驗結果如圖30 所示，由量測結果可以得知，我們的磁性蛋白質 Mn,Zn-MT-GFP

具有鐵磁性的性質，在300K 所具有得磁性約為 4x10^-5 emu，其飽和磁化量約為 1000

O.e，而在 10K 時所具有得磁性約為 8x10^-5 emu，其飽和磁化量約為 1000 O.e。

-1500 -1000 -500 0 500 1000 1500

-8 -4 0 4 8

M ag n et iz at io n ( x10

-5

em u )

Magnetic Field (Oe)

SQUID M-H Curve of Mn,Zn-MT-GFP at 10K SQUID M-H Curve of Mn,Zn-MT-GFP at 300K

圖30 磁性蛋白質 Mn,Zn-MT-GFP M.H 量測結果，紅色的線為在300K 所量測的結果，黑色的現為在 10K 所量測的結果

如圖31 為此實驗的對照組，一般而言蛋白質有機物為不具有鐵磁性的物質，由

本實驗室前輩的研究中得知MT 本身也不具有鐵磁性[99]，所以此實驗中直接檢驗我

們所加入的含金屬的藥品在沒有蛋白質將兩者結合的狀態下以及在極低溫沒有熱擾

動干擾的情況下是否具有磁性，來加以探討此磁性蛋白所具有的鐵磁性的現象是否

是因為錳以及鋅原子和蛋白質相互結合後產生類似Zinc-Blende 結構所導致。由實驗

結果的圖上我們可以很明顯的發現，若是只有錳以及鋅所結合的化合物不具有鐵磁

性，但是卻具有順磁性的現象，而此現象也更加強了我們的假設，讓因為錳以及鋅

離子和蛋白質相互結合後產生類似Zinc-Blende 結構使的原本不帶有磁性的有機物蛋

白質出現了鐵磁性的假設更具有說服力。

圖31 Mn,Zn 化合物在 10K 量測 M.H 結果，由圖中可知此樣品並沒有鐵磁性的訊號。

另一方面具有順磁性的化合物可以利用來當作MRI 的顯影劑，因此我們也嘗試

著做出此化合物，並故意加入大量的金屬故意讓其沉澱，再利用強磁鐵來吸此化合

物，結果發現，在液體中，此化合物會沿著磁力線方向排列（如圖32～34 所示）。

我們也利用liposome 將其包附其中並利用 TEM 進行影像以及成分分析，詳細結果會

在討論中加以詳談。

圖32 利用強磁鐵吸在 Mn,Zn 化合物的兩端，可以明顯看見已經有部分 Mn,Zn 化合物延磁力線方向站起

在文檔中 Mn,Zn-MTGFP融合蛋白磁性與結構分析 (頁 59-95)