實驗設備及耗材介紹

【高溫高壓滅菌爐】與【冷凍冷藏冰箱】

高溫高壓滅菌爐其功能為實驗所需器材與耗材滅菌，例如 1000 μl 滴管尖頭(Tips)、去離子水(DIWater)、血清瓶等，使用方法為 將器材或耗材先放入，並將裡面本身的去離子水調到一定高度規格，

然後鎖緊關上，溫度調到 121℃，時間調到 40 分鐘即可，如圖 3.1(a)。

冷凍冷藏冰箱，下層冷藏方面主將生長培養液(89%培養基+10%

胎牛血清(FBS)+1%抗生素(PS))、分化培養液(97%培養基+2%馬血清 (HS)+1%抗生素)、磷酸鹽溶液(PBS)、胰蛋白酵素(Trypsin-EDTA)等 儲存在 4⁰C 冰箱備用。上層冷凍方面則是將胎牛血清、馬血清、胰蛋 白酵素等儲存於負 20⁰C，如圖 3.1(b)。

圖 3.1 (a)高溫高壓滅菌爐、(b)冷凍冷藏冰箱

【無菌操作台】與【二氧化碳培養箱】

細胞實驗過程都需要在無菌操作台操作，首先開啟無菌操作台 (Larminar Flow)讓風扇運轉約3分鐘後，使空氣流動穩定，達到無菌 的平台，才可開始進行實驗操作，實驗完畢後，將實驗物品帶出工作 台，以75% 酒精(Ethanol)擦拭無菌操作台面，並開啟紫外光殺菌，

如圖3.2(a)。二氧化碳培養箱(Incubator)為細胞培養的環境，細胞 需要在恆溫37⁰與5%CO²中培養，需要定時補充滅菌水，如圖3.2(b)。

圖 3.2 (a)無菌操作台、(b)二氧化碳培養箱

【倒立式顯微鏡】與【恆溫水浴槽】

倒 立 式 顯 微 鏡 主 要 觀 察 細 胞 成 長 過 程 變 化 ， 並 利 用 Leica Application Suite V3.3.0 軟體拍照變化過程，將其圖片進行後續 分析，如圖 3.3(a)。恆溫水浴槽先將溫度加熱 37⁰C，接著將實驗所 需使用的耗材放入恆溫水浴槽加溫，等 25 分鐘讓溫度到達 37⁰C，即 可將實驗所需使用的耗材取出，才可以開始進行細胞培養，實驗耗材

例如，生長培養液(GM)、分化培養液(DM)、磷酸鹽溶液(PBS)、胰蛋 白酵素(Trypsin-EDTA)等，如圖 3.3(b)。

圖 3.3 (a)倒立式顯微鏡、(b)恆溫水浴槽

【自動吸放器】與【微量吸取器】

培養細胞過程用來吸取生長培養液(GM)、分化培養液(DM)、磷酸 鹽溶液(PBS)、胰蛋白酵素(Trypsin-EDTA)或廢液等液體，如圖 3.4(a) 吸取液體範圍為 1~10ml，圖 3.8(b)三隻微量吸取器依左到右吸取液 體範圍分別為 2~20μl、0.1~2.5μl、20~1000μl 等。

圖 3.4 (a)自動吸放器、(b)微量吸取器 (a)

(b)

【培養基過濾器】與【真空馬達】

培養基過濾器將培養基(DMEM)或磷酸鹽溶液(PBS)倒入過濾器 (Filter)漏斗中，再經過濾器過濾才可以保證是無菌的，過濾時間相 當緩慢，插入真空馬達，如圖 3.5(b)，可加快過濾速度，如圖 3.5(a) 培養基過濾器為可棄式，500 ml 規格。

圖 3.5 (a)培養基過濾器、(b)真空馬達

【計數盤】與【細胞染色劑】

計數盤主要用來數細胞控制每次繼代數量與實驗種植細胞數 量，使用時懸浮細胞液與細胞染色劑(Trypan Blue)一比一混合好，

細胞染色劑可以將活細胞外圍染色，用顯微鏡觀察可以看到活細胞外 圍是呈現白光，死細胞則會讓細胞染色劑滲入細胞裡使細胞整個呈現 白光，接著使用0~10μl滴管尖頭(Tip)取10μl注入計數盤中，再使 用計數盤公式，既可以算出細胞數量，如圖3.6(a)、(b)。公式算法

為計數盤裡有正方形九公格，每一個面積為1mm²，深度為0.1mm，每 一格體積為1mm²×0.1mm＝1.0×10^-4ml，數細胞時取五個正方格來計 算，分別為正方形四個外角與中間的正方格。

公式為（5大格細胞總數×2×10⁴）/5 ＝(細胞數/ml)。

圖3.6 (a)細胞染色劑、(b)計數盤

【液態氮】與【漸凍盒】

液態氮溫度為負197⁰C，主要是將細胞冷凍保存在液態氮裡，可 長期保存，使用細胞時再從液態氮裡拿出新細胞，漸凍盒主要是細胞 冷凍過程放在負80⁰C冰箱可以慢慢降溫，一般盒子需先存放在負5⁰C 與負20⁰C各30分鐘後，才可放到負80⁰C，等過夜或16小時候，再將冷 凍管放入液態氮裡保存，如圖3.7(a)、(b)。

【針頭式過濾器】與【負80

C冰箱】

針頭式過濾器(Filter)孔徑為0.22μm，配合針筒一起使用，過

濾完之液體為無菌，本實驗主要用來過濾濃度0.1%明膠(Gelatin)溶 液，負80⁰C冰箱功能為冷凍細胞過程中需放在負80⁰C隔夜或16小時才 可將冷凍管放入液態氮裡保存，如圖3.8(a)、(b)、(c)。

圖3.7 (a) 液態氮、(b) 漸凍盒

圖3.8 (a)針頭式過濾器、(b)針筒、(c)負80⁰C冰箱

【細胞培養耗材】

細胞培養耗材如圖 3.9 分別有 15m1 與 50ml 離心管、直徑 3.5、

6cm 培養皿、1000μl 滴管尖頭(Tips)、T25-燒瓶(flasks)、10mL 玻

璃吸管等，使用時每個角落需徹底噴 75%酒精才可放入無菌操作台使 用，為一次使用性不可重複使用。

圖 3.9 細胞培養耗材

((a)15ml 離心管、(b)50ml 離心管、(c)1000μl 滴管尖頭(Tips)、

(d)直徑 3.5、6cm 培養皿、(e) 10ml 玻璃吸管、(f) T25-燒瓶(flasks))

【培養基的配法】與【磷酸鹽溶液】

首先各別將培養基放入 700ml 二次水與碳酸氫鈉溶液放入 200ml 二次水，利用磁石攪拌機攪拌 700ml 培養基，再將 200ml 之碳酸氫鈉 水溶液慢慢加入，碳酸氫鈉才不破壞培養基之性質，接著利用過濾器 (Filter)過濾，生長培養液(89%DMEM+10%FBS+1%PS)為

DMEM(Dulbecco^﹐s Modified Eagle^﹐s Medium )加入 10％胎牛血清

(Fetal Bovine Serum，FBD)與 1％抗生素(100ug/ml Penicillin and

100ug/ml Streptomycin，PS)均勻沖散，分化培養液

(97%DMEM+2%FBS+1%PS)為 DMEM 加入 2％馬血清(Horse Serum，HS)與 1％抗生素均勻沖散。將一包磷酸鹽粉末(Phosphate-Buffered Saline，PBS)與 1000ml 二次水利用磁石攪拌均勻，接著利用過濾器 (Filter)過濾。

胰蛋白酵素 trypsin-EDTA Hyclone

磷酸鹽溶液 PBS Hyclone