松年 Matsumura (1936)最早以台灣寬尾鳳蝶 (A. maraho)為模式種建 立了寬尾鳳蝶屬，此屬的建立有效性也被一些學者認可(例如，白水，
1960、五十嵐，1979、黃等，1993、周，1994)。但是有些學者則有 不同意見。Monroe 將中華寬尾鳳蝶(A. elwesi )置於與鳳蝶屬( Papilio Linnaeus, 1758)II(A)節(Section)之中。而其它的學者亦認為台灣寬尾 鳳蝶及中華寬尾鳳蝶應置於鳳蝶屬內 (例如，D’Abrera,1982、Muňoz
＆ Corrochano, 2000)。另外，Hancock (1983)將中華寬尾鳳蝶置於斑 鳳蝶屬 (Chilasa Moore, [1881]) 內，此一處理亦獲得 Sillen-Tullberg (1988) 及 Häuser (2002)等研究者沿用。
研究寬尾鳳蝶屬的有效性是一個重要的研究課題。台灣寬尾鳳蝶 是台灣珍貴稀有的特有蝶種，亦是 IUCN 紅皮書中所舉列「易
危」”vulnerable”等級的物種 (Collins & Morris, 1985)。台灣寬尾鳳蝶 是從 1994 年開始被列為瀕危物種 (鄭等，1996；顏及楊，2000； Yen 華寬尾鳳蝶白斑型(A. elwesi f. cavalerei)都與麝鳳蝶屬 Byasa 之
latrellei 群的物種(後翅有白斑)呈共域分佈(sympatry)。麝鳳蝶因以馬
兜鈴屬（Aristolochia spp.）植物為寄主，因此在翅膀及身體都對天敵 COII(Cytochrome Oxidase I and II)及 Ef1α (Elongation factor 1α)基因已 有 大 量 的 序 列 發 表 ( 例 如 Caterino ＆ Sperling, 1999; Reed ＆ Sperling, 1999; Caterino et al., 2001; Zakharov et al., 2004; Nazari et al., 2006)。本研究從中選擇 103 種鳳蝶具有 COI + COII 或 Ef1α 基因的 樣本以進行分析。此外，增加 22 種(共 38 個樣本)未發表序列，以了 解寬尾鳳蝶屬最近緣外群及擬態關係。這些樣本包括 3 型寬尾鳳蝶屬 的蝴蝶、9 種斑鳳蝶屬以及 2 種鉤鳳蝶屬 Meandrusa 的蝴蝶。此外尚 未發表序列的廣義鳳蝶屬種類如 Papilio demolion, P. hopponis, P.
castor, P. thaiwanus 以及青鳳蝶屬的 Graphium cloanthus, G. doson, G.
eurous, G. sarpedon 和黃裳鳳蝶 Troides aeacus 亦加入以進行分析。
本論文研究所有使用於分析的樣本都列於 Table 4 之中。台灣寬尾鳳
蝶及黃裳鳳蝶都經過事先申請，並在行政院農業委員會的核可後進行 採集與各項研究分析。
DNA
萃取 萃取、 萃取 萃取 、 、核酸鏈合反應 、 核酸鏈合反應 核酸鏈合反應（ 核酸鏈合反應 （ （ （
PCR） ）、 ） ） 、 、 、定序 定序 定序 定序
粗 DNA 的萃取採自蝴蝶胸部肌肉組織，萃取的藥品採用 Purgene DNA Isolation kit (Gentra Systems)，並參照其所指示的萃取流程進行 操作。最後已萃取完的 DNA 加入 50µl 無菌水以配成 DNA 溶液。每 個 PCR 反應包含的藥品包括 0.8µl 的 2.5mM dNTP、 1.5µl 的 25mM MgCl2、0.5µl 的 10µM 核酸引子(DNA 兩股各一個)、2.5µl 的 10X Taq buffer、0.1µl of Taq (Amersham Biosciences Corp.)，以及 0.5µl 的 DNA 溶液，最後加一次水到 25µl。PCR 反應設定為第一步驟為：94℃，2 Gel/PCR Clean Up kit (Geneaid)純化反應用並在定序儀 ABI3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems)，進行定序。
親緣關係分析 親緣關係分析 親緣關係分析 親緣關係分析
序列的品質及校正利用 Sequencher 4.5 (GeneCode Corp.)套裝軟 體進行分析。序列的基因定位與已發表的黃果蠅 Drosophila yakuba (Clary ＆ Wolstenholme, 1985) 及家蠶 Bombyx mori (Yukuhiro et al., 2002)的基因進行確認。所定出的序列會去除含有核酸引子的區域及 tRNA 基因。最後切齊序列以進行分析。序列資料對排序是以胺基酸
序列進行比對，利用 ClustralW in MEGA 3.1 (Kumar et al., 2004)進行 分析，分析時以預設值設定(gap opening penalty＝10, gap extension penalty＝0.2)。
與親緣關係分析有關的方法，諸如鹼基頻率同源度 homogeneity of base frequency 、 不 吻 合 長 度 差 異 測 試 Incongruence Length Difference (ILD) test、最大儉約性 maximum parsimony (MP)、拔靴法 bootstrap、核苷酸演替模式 Modeltest 及布氏支持 Bremer support (Bremer, 1988)等，都經由 PAUP*10b 軟體進行測試。分割及合併的資 料(Partitioned and combined dataset)都以進行 homogeneity of base composition 的測試。ILD 測試的設定是以窮盡收尋法 heuristic search 並包括 100 次的 TBR branch swapping。
在初步分析中，為得到寬尾鳳蝶屬、斑鳳蝶屬及其他蝴蝶之間的 正確親緣關係，我們以不同的內群及外群的組合找出最近緣的「功能 外群」(functional outgroup)。起初以 Hylephila phyleu
s
、 Pieris napi 及 Colias eurytheme 當作外群，其餘 136 個分類單元(taxa)為內群(但 以 BI method 分析時僅以 H. phyleus 為外群進行分析)。所有分割(COI + COII or Ef1 α)或是合併的資料所分析的結果都 顯示寬尾鳳蝶屬及斑鳳蝶屬的蝴蝶都包含在廣義鳳蝶屬內，並且鉤鳳 蝶 Meandrusa payeni 是最近緣的外群。因此接下來 的分析則將 Meandrusa 屬以外關係較遠的外群(53 個分類單元)移除以避免長演化 支吸引效應（long branch attraction）。此外，內群如 Chilasa agesto
r
、 C. epycides
、 C. clytia
、 Papilio dialis 及 P. epiphorbas 原來有多 個序列樣本，在接下來的分析僅以一個樣本的序列進行分析。最後僅 餘 76 個鳳蝶族的鳳蝶進行親緣關係分析。最大儉約分析 最大儉約分析 最大儉約分析
最大儉約分析
MP analyses最初的最大檢約樹 MP trees 以窮盡收尋法 heuristic searches 方式 進行搜尋，最初的樹搜尋設定以 1000 個隨機分類單元，並設定 tree bisection-reconnection (TBR) branch swapping algorithm，而間隙(gaps) 則處理成遺失資料（missing data），而多態特徵（multiple character states）則處理成未確定特徵（uncertainty），其它特徵則處理成相同 加權(equally weighted)。分開的資料庫(COI + COII and Ef1α)以及合起 來的資料庫(COI + COII + Ef1 α)將被用於分析，產生的 MP 分枝樹形 圖均採用 bootstrap value (Felsenstein, 1985) 以及 Bremer support (Bremer, 1988) 進行 統計 檢測 。 Bootstrap 分 析係 採用窮 盡收 尋 法 heuristic searches 方法，包含外加 100 個隨機的分類單元，以及 TBR 演算法。Bootstrap 採用 1000 次的重複檢測，而 Bremer support 則採 用電腦程式 TreeRot (Sorenson, 1999)連結 PAUP*軟體計算，分開的 Bremer support (PBS)於結合的資料被採用時，也會針對每一部份合起 來的資料作檢測。
BI analyses
Bayesian analysis 採用結合的以及分開的資料，以 MrBayes 3.1.2 軟體(Huelsenbeck & Ronquist, 2001)完成分析，建構於 General Time Reversible (GTR)模型(Rodrígues et al., 1990)，常數是(I)以及 gamma 分佈。每百萬世代本研究採取跑六條鍊（5 條熱 1 條冷）以及每一百 世代取樣樹。最後，跑多餘的兩次以保證所得到的枝序圖不會是局部 最理想的結果。log-likelihood scores 當達到穩定不動時可用於反推確 定一世代時間。所有測試點若未達穩定不動則「燃燒」剔除，而剩下 的則呈現出最後的可能性。
ML analyses 酸演替模式(model)均是由 Modletest 3.06 版程式(Posada and Crandall 1998)所推算而得。在操作時，核苷酸頻率以實際運算值“empirical” (864bp)長度存在著些差異(Caterino ＆ Sperling, 2001; Zakharov et al., 2004; Silva-brandão et al., 2005)。目前沒有在本研究外加 22 個物種的 38 個樣本中發現有嵌入（insertion）或是遺失（deletion）的現象。有 三個樣本，包括 Graphium doson (Specimen 2)樣本、Agehana elwesi (specimen 1)
、
Agehana elwesi (specimen 5)，已經被排除在資料庫外，因為牠們在其餘樣本中均呈現相同的 haplotype。
在不同的資料(partitioned genes)中並沒有核苷酸組成上的差異
(base composition heterogeneity)(Table 7)，但是核苷酸組成差異在不同 的基因間有顯著不同。因此我們採取資料合併及分開的方法進行進行 親緣關係樹的建立。粒線體 DNA 的基因表現出偏向 A+T 鹽基的比例 (71.8％-85.2)，而核 DNA 僅佔 38.1％~48.6％。但是如果只算密碼子 (codon)第三個位點，其變異為 71％~93.3％之間。
在一開始的數據(n＝139)，以 ILD 檢測顯示由 COI + COII 基因的 資料庫呈現同質性(homologous)，若是將資料改成 COI + COII 與 Ef1 α，或是 COI、COII 與 Ef1 α，則呈現出異質性(heterogeneous) (Table 4)。不管怎樣，在 76 個分類單元的資料庫中，以 ILD 檢測呈現與一
呈現)。但是，皆顯示 Papilionini 是個單系群，而且鉤鳳蝶屬 Meandrusa + Agehana + Papilio alexanor 的關係比 Heraclides 更近。而基於 76 個 分類單元的結合資料庫（COI + COII + Ef1 α）而得的支序圖顯示，主
Zakharov et al.（2004）針對廣義鳳蝶屬 Papilio（約有205種）選 取51種進行親緣關係的研究，結果支序圖顯示主要分為兩大群，一群 是具有高支持度狹義鳳蝶屬，另一群為中等支持度的 Pterourus ＋
Chilasa
＋Heraclides
。雖然後者的支持程度並不高，但是此類群內 的蝶種大部分具有擬態的情況，在演化研究中扮演重要角色。過去寬尾鳳蝶傾向併入
Chilasa
屬內，因為其分佈與亞洲分佈為 主的Chilasa
較為共域，但是，本研究使用不同的資料（COI＋COII，Ef1 α，COI + COII + Ef1 α）所獲得的支序圖樹形其支持度雖然與 Zakharov et al.（2004）的研究相似，僅有中等的支持度，但都顯示 Agehana 與
Chilasa
的關係較 Pterourus 的關係遠。也就是說與寬尾 鳳蝶關係最近緣的是 Pterourus 屬的鳳蝶，其次才是Chilasa
屬的鳳 蝶。利用分子時鐘（molecular clock）來推估分化時間，每百萬年核 苷 酸 有 2 ％ 的 變 異 點 ， 此 一 標 準 適 用 於 其 他 昆 蟲 之 COI 、 COII
（DeSalle et al.,1987; Brower, 1994）。本研究以COI + COII的資料來推 估寬尾鳳蝶與分佈北美的Pterourus 分化時間，大約介於二千萬年前 至二千六百萬年前之間。這一推估結果與Zakharov et al.（2004）的研 究推估廣義鳳蝶屬的分化時間（始於五千五百萬年前至六千五百萬年 之間）比較，推估時間尚屬合理。
Zakharov et al.（2004）的研究中狹義鳳蝶屬的支持度極高，有趣 的是原屬於Munroe（1961）所歸為Papilio section II 之亞歷桑納鳳蝶 Papilio alexanor 卻與
Chilasa
、Pterourus 歸為一群。此一結果與本研 究的結果相符，不管是何種資料（Ef1 α，COI＋COII， COI + COII + Ef1 α）結果均顯示：P. alexanor 與Chilasa
、Pterourus 歸為一群，而 不屬於狹義鳳蝶屬。因此亞歷桑納鳳蝶之系統發育情形，分類處理以 及是否存在有擬態機制等，有待進一步深入探究。由本研究之三個主要支序圖的結果顯示（figs. 12-14），寬尾鳳 蝶屬的兩個分類群彼此的分化時間極短（以COI + COII的資料來推估 分化時間，大約介於二十萬年前至三十萬年前之間）且關係非常近 緣，更與北美地區的Pterourus屬的鳳蝶結合成單系群（monophyletic group）。此一結果產生了一個極戲劇性的與討論空間。因為，一直以 來北美地區的Pterourus屬的鳳蝶是被許多學者嚴格檢視，並認為是一 個完整的單系群分類單元。分屬兩個動物地理區系的類群竟存在有單 系群的情況，顯現出其生物地理學上可值得深入探討之處，例如寬尾 鳳蝶是否為Pterourus屬從北美洲回遷至亞洲而快速種化的一支系？
寬尾鳳蝶的屬級定位若是成立，那麼顯然Pterourus屬則會成為並 系群（paraphyletic group）的現象。因此本研究的初步結果建議暫時
將寬尾鳳蝶屬處理成廣義鳳蝶屬 (Papilio sensu lato)的一亞屬，或是 併入Pterourus屬。未來有待進行更多相關的分子研究及形態資料等，
取得更多的分類證據來深入釐清寬尾鳳蝶系統發育的情形，以及其相 關近緣類群間的演化關係等。