小球藻

本研究所選用之小球藻分類為植物界 (Plantae)、綠藻門 (Chlorophyta)、綠 球藻綱 (Chlorophyceae)、綠球藻目 (Chlorocaccales)、綠球藻科 (Chlorellaceae)、

綠球藻屬 (Chlorella)中的綠球藻 (Chlorella vulgaris)，又稱小球藻。小球藻是單 細胞藻類、為真核生物、形狀為圓形、直徑約 3-8 m，須以顯微鏡觀察。是五 億四千年前便已存在於環境之中的生物，為水生環境中生質量大的浮游植物，光 合作用強，並含有豐富蛋白質、礦物質、葉綠素，除了具有營養價值、可作為保 健食品、增強人體免疫外，也具有生物吸附重金屬之能力，可作為水中淨化之用，

透過研究，小球藻會經由生物吸附作用吸附 Pb²⁺離子 (LI et al., 2007)。同時小球 藻是急毒性試驗的試驗生物，也是作為水蚤的飼料之一。

在前人研究中，曾進行 40 種除草劑對於小球藻之毒性暴露試驗，其中以抑 制 acetyl-CoA carboxylase (ACCase)、抑制脂質形成 (Lipid Synthesis Inhibitor) 、 Protox inhibitors 的除草劑對於小球藻的急毒性最高 (Ma et al., 2002a)。在殺菌劑 對於綠藻類的毒性影響上，免賴得對於另一種綠藻 Chlorella pyrenoidosa 的毒性 是殺菌劑中最高，相較而言，甲基多保淨的毒性較低 (Ma et al., 2002b)。

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三、 研究目的

農藥混合施用之優點為同時防治病蟲害、提高用藥效率，以及混用不同作用 機制之藥劑可提高藥效、避免抗藥性，然而，混合施用會造成不同的毒性效應，

對於環境中的生物產生不同的毒性影響。本研究選擇台灣地區用量大、同時施用 於水田的農藥試驗，所選用的是殺菌劑甲基多保淨、貝芬替，以及殺蟲劑益達胺，

用以探討殺菌劑與殺蟲劑混合施用對於水中非目標生物之毒性影響。

本研究會進行三種非目標生物 (水蚤、端足蟲及綠藻) 對於殺菌劑與殺蟲劑 單一的毒性試驗，以及殺菌劑與殺蟲劑混合暴露的毒性試驗，探討不同物種對於 農藥的敏感度、作為適合的生物指標，並討論混合暴露所造成的毒性效應影響。

25 Germany，純度 99.5%。

d. 貝芬替 (Carbendazim) 標準品：購自 SIGMA-ALDRICH, Germany，純度 99.2%。

e. 益達胺 (Imidacloprid) 標準品：購自 RDH，純度 99.9%。

(2) 儀器設備

a. 高效能液相層析儀 (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) ：HITACHI Primaide 1410 pump and 1110 UV detector b. 層析管柱：C-18 column (KANTO CHEMICAL Co., INC. Mightysil

RP -18 GP 250-4.6, 5 m)。

c. 電腦數據分析軟體

d. 10 mL 定量瓶：日本 SIBATA 公司。

e. 50 mL、250 mL 玻璃燒杯 f. 10 mL 棕色瓶

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表六、以 HPLC 分析本試驗用藥之條件 Table 6 Pesticide detected condition by HPLC

農藥 偵測波長 水 氰甲烷 流速 注入體積

Table 7 The calibration and determination coefficient in HPLC condition

農藥 檢量線公式 R²

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Table 8 Detected concentration of pesticides in water stability test Pesticide Nominal

concentration (mg L^-1)

Test period

0 h 24 h 48 h

Thiophanate-methyl

0.5 0.4960.01 0.5370.24 0.5540.08 5 6.5590.24 8.5001.23 10.261.83 100 107.994.41 162.424.51 161.9023.23 Carbendazim 0.2 0.2850.0009 0.2950.0016 0.29980.0131

2.5 2.5690.421 4.2650.781 6.4610.789 15 18.2411.083 12.3100.521 11.8421.685 Imidacloprid 8 6.7960.035 8.4630.268 9.8681.237

100 89.9411.08 113.5101.975 146.1973.187

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（二） 急毒性試驗

1. 水蚤 (D. pulex) 48 小時急毒性試驗

(參考環保署水樣急毒性檢測方法─水蚤靜水式 NIEA B901.12B，2005)

(1) 設備

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31 間進行進一步濃度試驗，最後以 SPEARMAN 程式，運用 Trimmed

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Spearman-Karber Method 估計 LC₅₀數值。

(10) 標準毒物試驗結果

使用參考毒物 CdCl2做預實驗，測試所選用之水蚤的敏感度，所得之 EC50值 為 0.100.305 mg L^-1，與檢驗方法中之參考質相近 (LC50 = 0.105 mg L^-1)，因 此確認所使用之水蚤準確性無疑。

2. 端足蟲 (H. azteca) 72 小時急毒性試驗

(1) 設備

玻璃燒杯 (250 mL、1 L) 、PEODAC CRYSTALCIL SINTERED GLASS CYCLINDER MEDIA 高溫燒結玻璃圓柱型濾材玻璃生物環 (簡稱石英 磚) 、塑膠滴管、玻璃盤、不鏽鋼篩網 (0.5 m/m、1 m/m、2.0 m/m) 、烘箱 (40℃) 、天秤。

(2) 試劑

TAYAGI Ocean Life NO.1 Sun-Flower 水晶蝦增艷專用飼料

(3) 端足蟲馴養

a. 所使用之端足蟲取自環檢所，於恆溫、光照下，加入曝氣後的水與洗淨 烘乾之石英磚，石英磚用以模擬底棲環境、使端足蟲躲避。

b. 於春夏時，端足蟲繁衍速率較快，適宜實驗。每一缸密度不宜超過 200 隻，使端足蟲生長狀況良好。

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間進行進一步濃度試驗，最後以 SPEARMAN 程式，運用 Trimmed Spearman-Karber Method 估計 LC50數值。

3. 小球藻 (C. vulgaris Beij.) 24 小時急毒性試驗

(參考環保署水樣急毒性檢測方法─藻類靜水式 NIEA B906.10B，2004 與環保署水中葉綠素 a 檢測方法─乙醇萃取法 NIEA E508.00B，2002)

(1) 設備

溫度計 (0~50℃) 、pH 計、迴旋搖盪培養器、恆溫培養室 (271℃) 、分光 光度計 (使用 Infinite® 200 PRO + i-control 1.8.20.0) 、天秤 (可精秤至 0.1 mg) 、照明設備 (可達 100~200 mol.m^-2.s^-1) 、三角錐瓶 (125 mL 與 250 mL) 、玻璃燒杯 (1 L) 、無菌過濾裝置、光學顯微鏡、水浴槽 (可維持在 601℃) 、離心機 (轉速可達 3000 g 以上) 、離心管 (10 mL) 、微量吸管、

冰箱 (4℃)

(2) 試劑

葉綠素 a 標準品、稀釋水 (二次去離子水) 、10%硝酸溶液、丙酮、參考毒物 氯化鎘 (CdCl₂‧H₂O) 、90% (v/v) 乙醇 (分析級) 、1 M HCl (量取 82.9 mL HCl (37%，比重 1.19) ，添加於 1 L 去離子水中) 。繼代培養使用花寶二號 (添 加濃度 0.1 mg L^-1) 。用於藻類培養急毒性測試之基礎培養液，使用 Bold’s basal medium (10X) (HIMEDIA) ，其組成如表九所示。

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37 小時培養後其生長速率受 50%抑制之濃度 (Median inhibition effect concentration, EC50) 及最高無抑制濃度 (No observed effect

concentration, NOEC) 。EC50之求法以圖解法 (Graphic method) 為 之，NOEC 則以統計或圖解內插法求之，以生長速率達對照組之 95%

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表九、Bold’s basal medium 之組成成分 Table 8 The ingredients of Bold’s basal medium Ingredients mg/100 mL Sodium nitrate 0.00025 Calcium chloride‧2H2O 0.000025 Magnesium sulphate 0.000075 Potassium phosphate dibasic 0.000075 Potassium phosphate monobasic 0.000175 Sodium chloride 0.000025

EDTA 0.000050

Potassium hydroxide 0.000031 Ferrous sulphate‧7H₂O 0.000005 Sulphuric acid 0.000001

Boric acid 0.000011

Zinc sulphate‧7H2O 0.000009 Manganese chloride‧4H₂O 0.0000014 Molybdenum trioxide 0.0000007 Copper sulphate‧5H₂O 0.0000016 Cobalt nitrate‧6H2O 0.00000049

TOTAL 1.02

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（四） 統計分析

半致死濃度 LC50以 SPEARMAN 程式，運用 Trimmed Spearman-Karber Method 估計。濃度與致死率之間的比較使用 t-test 進行分析，具顯著性差異者會 以*與**號表示 (*：p<0.1；**：p<0.05) 。在等毒性混合時，使用 R software 套 用 dose-response curve (drc)套件，利用 three-logistic model 函數繪製對數圖形 (Ritz and Streibig, 2005)。

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42 兩種端足蟲來得低，Gammarus fossarum 暴露於益達胺的 EC50 (24h)(effect=癱瘓) 為 0.07 mg L^-1、LC₅₀ (48h)為 0.8 mg L^-1 (Lukancic et al., 2010)，Gammarus pulex (disorientation) 的情況產生 (Malev et al., 2012)，此類情形在節肢動物糠蝦目 Neomysis integer 暴露於有機磷殺蟲劑中時所產生的迴避性反應 (avoidance response) 相似 (Roast et al., 2000)，這些活動上的反應的產生也被視為生物受到

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在殺菌劑貝芬替上，本研究所選用的物種則是具有較高的 LC₅₀值。在 G. pulex 上，LC50為 0.403 nmol L^-1 (0.077 mg L^-1) (van Wijngaarden et al., 1998)，G. fassarum 的 EC₅₀ (7d)為 0.075 mg L^-1、LC₅₀ (7d)為 0.051 mg L^-1 (Zubrod et al., 2014)。貝芬 替在大於 0.1 mg L^-1的濃度下，被發現對於端足蟲具有致死性的毒性危害 (Cuppen et al., 2000)，說明了貝芬替對於底棲生物端足蟲依舊具有潛在的毒性危 害可能。