二 二
二、 、 、 、DPTH-N10
DPTH (5,5-diphenyl-2-thiohydantoin) 為 抗 癲 癇 藥 物 phenytoin (Dilantin; 5,5-diphenylhydantoin)之相似物(analogue)。本實驗室之前的 研究發現 DPTH 可以使人類臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell; HUVEC)停止生長，並藉由增加 p21 蛋白的表現量而 使細胞週期停止在 G0/G1 期(Shih et al., 2004)。而之後的研究更進一 步合成出一系列的 DPTH 的衍生物，並發現其中 DPTH-N10(圖一)抑 制 HUVEC 生長的作用最強，高達 DPTH 的 5 倍之多(Cheng et al., 2008)。實驗發現 DPTH-N10 除了可以使 p21 蛋白增加、降低 CDK2 的 kinase 活性而抑制 HUVEC 生長，而且也初步發現對大腸癌細胞
phase, S (Synthesis) phase, G2 (Gap2) phase, M (Mitosis) phase, 最後分 裂成兩個子代細胞。而癌細胞與正常細胞相反，其特徵就是不受調控 的生長與分裂。細胞進入細胞週期時，主要由不同的 Cyclins 及 CDKs (Cyclin-dependent kinases)在特定的 check point 共同調控及作用來決 定是否進入下一個階段，或停留在目前的階段(Hunter and Pines, 1994)。而癌細胞內調控細胞週期的機制會產生突變，導致癌細胞往 往不受調控而開始失去秩序，不停地生長。
CDKs 主要促進細胞週期的進行，而 CDKs 蛋白需要 Cyclin 蛋白 來調控活性。不同的 Cyclin/CDKs complex 調控不同時期的細胞週 期。目前至少有九種不同的 CDK 及 12 種以上的 Cyclin 在調控細胞 週期，其中主要負責細胞週期進行的蛋白有: Cylin D/CDK4、Cyclin E/CDK2、Cyclin A/CDKS 及 Cyclin B/CDK1(CDC2) 。另外有些蛋白 質則是會抑制 CDKs 及 Cyclin 的作用使細胞週期停頓下來，如 APC、
p21、p27 及 p53 等。而癌細胞則因為某些突變使原本能抑制細胞週 期進行的蛋白質失去功能，如大腸癌細胞被發現往往會有 APC 與 p53 基因的突變導致細胞週期失控，使細胞不停的分裂生長。
G1 時 期 主 要 的 調 控 蛋 白 是 CDK2, CDK4, CDK6, CyclinD1,
CyclinD3 及 CyclinE; 早期及中期由 D type Cyclins/CDK4 及 CDK6 調 因的表現(Weinberg, 1995)。Rb 磷酸化是細胞通過 restriction point 的 關鍵。有研究指出，Rb 過度表現的細胞不需要 Cyclin 和 CDK 的活 transcription factor，活化其下游基因 p21 蛋白的表現。p21 可以藉由 和 Cyclin/CDKs 形成 ternary complex 抑制 CDKs 活性而抑制細胞週期 的進行(Xiong et al., 1993)。至於 p27 在 G1 時期會結合在 CDK2 的 AT 位置上導致 Cyclin E/CDK2 無法作用，使細胞停留在 G1 期無法進入
到 S 時期，一直到 p27 被分解之後，Cyclin E/CDK2 會恢復活性，細 胞繼續進入 S 時期(Coats et al., 1996)。
S 時期早期調控的蛋白是 Cyclin E/CDK2。Cyclin E/CDK2 主要和 centrosome 的複製有關，CDK2 的活性則和 DNA 複製相關。S 時期 的晚期 Cyclin A 和 CDK2 形成複合物，再和 CDC2 形成複合物，此 善。除了經美國 FDA 核可關於細胞毒素的藥物(cytotoxic agents):
irinotecan (Camptosar)、oxaliplatin (Eloxatin)及 capecitabine (Xeloda)
之外，由於近年來，有關於細胞週期、細胞凋亡(apoptosis)及血管新 生（angiogenesis)等分子調控途徑的了解，在癌症治療上發展出許多 新 的 標 靶 治 療 。 Bevacizumab (Avastin) 可 抑 制 血 管 內 皮 生 長 因 子 (vascular endothelial growth factor)的作用而達到抑制血管增生的效果;
cetuximab (Erbitux)及 panitumumab (Vectibix)兩者皆為上皮生長因子 (epidermal growth factor)接受器的抗體，以上幾種藥物已在臨床上證 明了它們的療效(Pohl et al., 2008)。如何發展更有效的抗癌藥物是目 前的研究趨勢。
本研究的目的是在探討 DPTH-N10 直接抑制大腸癌細胞增殖現 象及其分子作用機制。由於血管新生（angiogenesis)對癌細胞的生長 及轉移之重要性已被廣泛的接受 (Folkman, 1971; O'Reilly et al., 1994)，因此臨床上持續在尋找針對抑制血管新生來幫助惡性腫瘤的 治 療方 式 。 根 據 本 實 驗 室 的 先 前 研 究 及 本 計 畫 之 研 究 結 果 顯 示 DPTH-N10 具有抑制血管新生及直接抑制癌細胞增殖的雙重機制，因 此非常有希望發展成為新一代的抗癌藥物。
貮
1. Phosphate Buffer Saline (PBS)
0.14M NaCl, 2.7mM KCl, 1.5mM KH2PO4, 8.1mM NaHPO4
2. SDS-PAGE electrophoresis buffer (running buffer)
25mM Tris-HCl, 250mM glycine, 0.1% SDS, ddH2O, 調整至 PH 值 8.3
3.Towbin transfer buffer (for Western blotting)
25mM Tris base, 192mM glycine, 20% methanol, dd H2O, 調整至 PH 值 8.3
4.TBS-T buffer
10mM Tris (PH7.5), 100mM NaCl, 0.1% Tween-20 5.Western sample buffer (loading eye)
100mM Tris(PH6.8), 200Mm DTT, 4% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20% glycerol
6.protein lysis buffer (Gold buffer)
137mM NaCl, 10mM NaF, 5mM EDTA, 1mM EGTA, 20mM Tris(PH7.9), 10%(v/v)glycerol, 1% triton X-100, 1mM sodium
orthovanadate(Na3VO4),1mM sodium pyrophosphate (Na2H2P2O7-NaPP), 1mM PMSF, 10µg/ml leupeptin ( 或 以 proteinase inhibitor cocktail 取代上述 proteinase inhibitors)
7.Immunoprecipitation buffer (I.P. buffer)
10mM Tris PH7.4, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5%NP-40, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM sodium orthovanadate, 0.2mM PMSF, 10µg/ml aprotinin, 1µg/ml leupeptin
8.Kinase buffer
50mM HEPES PH7.4, 10mM MaCl2, 2.5mM EDTA, 10mM β-glycerophosphate, 1mM NaF, 1mM DTT(dithiothreitol), 10mM PNPP(p-nitrophenylphosphate), 300µM sodium orthovanadate, 1mM benzamidine, 10µg/ml aprotinin, 1µg/ml leupeptin
(二) 藥品試劑
DPTH-N10（由臺北醫學大學藥學系吳建德老師實驗室合成）、 40% acrylamide (購自 Bio-Rad)、95% ethanol (購自美美科技) 、 Ammonium persulfate (購自 Bio-Rad)、BSA 蛋白質濃度測定組(購自 SIGMA) 、DMEM medium (購自 GibcoBRL) 、Fetal bovine serum (購 自 Hyclone) 、Isotone(購自 BECKMAN COULTER) 、RPMI 1640
medium powder ( 購 自 GibcoBRL) 、 [Methyl-3H]-thymidine ( 購 自 DuPont/NEN) 、MTT (購自 SIGMA) 、Scintillation cocktail solution (購 自 National diagnostics) 、TEMED (購自 Bio-Rad)、Trichloroacetic acid (購自 SIGMA) 、Trypsin-EDTA (購自 GibcoBRL)
Alkaline phophatase-conjugated goat anti-mouse IgG(H+L) (購自 Jackson)、Alkaline phophatase-conjugated goat anti-rabbit IgG(H+L) (購 自 Jackson)、Anti-alpha tubulin mouse immunoaffinity purified IgG (購 自 2YMED laboratories) 、Anti-cdk2 mouse immunoaffinity purified IgG (購自 Transduction laboratories) 、 Anti-cdk4 mouse immunoaffinity purified IgG (購自 Transduction laboratories) 、Anti-cyclin A rabbit immunoaffinity purified IgG ( 購 自 Transduction laboratories) 、 Anti-cyclin D1 mouse immunoaffinity purified IgG (購自 PharMingen International) 、Anti-cyclin D3 mouse immunoaffinity purified IgG (購自 Transduction laboratories) 、Anti-cyclin E rabbit immunoaffinity purified IgG (購自 upstate biotechnology) 、Anti-G3PDH mouse immunoaffinity purified IgG ( 購 自 Biogenesis) 、 Anti-p21 mouse immunoaffinity purified IgG ( 購 自 Transduction laboratories) 、 Anti-p21 mouse immunoaffinity purified IgG (購自 Transduction laboratories) 、Anti-p27 mouse immunoaffinity purified IgG (購自 Transduction laboratories) 、
Anti-p53 mouse immunoaffinity purified IgG (購自 Santa Cruz) (三) 常用儀器
倒立式相位差顯微鏡: OLYMPUS 細胞培養盤: IWAKI
75mm BD tube: FALCON 離心管: NUNC Brand Products
細胞培養箱(Incubator): Nuaire CO2 water-jacketed incubator 無菌操作台(Laminar Flow): 海天 4BH-24
振盪器: Vortex-2 genin
乾浴槽: Multi-Block Heater(Lab-Line) 水浴槽: YIHDERN BT-150
烘箱: Cherng Huei
高轉速離心機: Kubota 1820; Kubota
中型離心機: Digisystem laboratory instrument, INC.
垂直式電泳槽: Hoefer SE400(Bio-Rad) 電源供應器(Power Supply): OWL OSP-105 電轉印槽(electrotransfer tank): Hoffer TE 42
酸鹼測定儀(PH meter): Radiometer Copenhagen PHM 210 高壓殺菌斧: Tomin
加熱板: corning stirrer/hot plate 天平: AND EK-120A
分光光度計(Spectrophotometer): Hitachi
超低溫冷凍櫃: Puffer Hubbard(Harris Manufacturing Company) Shacker: Digisystem laboratory instrument, INC. DSR2800V
閃爍計數器（Scintillation Counter）: BD Incorporation Beta-counter
二、
細胞培養 (cell culture)
1640 medium 終止 Trypsin-EDTA 的作用。離心除去上清液，留下細後，再加入 10% FBS-RPMI 1640 培養液，將細胞打散成單一細胞, 均 勻分布於培養液中, 可繼代至四到六盤的培養皿。
三、 3
H-Thymidine Incorporation Assay
將細胞種在 24-well 培養盤（約 2,000 顆細胞/well）中，待細胞 長至 6~7 分滿時，加入 0.04 % FBS 的 medium 培養 24 小時，使大部 份細胞停滯在 G0/G1。將培養液中的 FBS 增加至 10 %並同時予以加 藥處理，在收實驗的時間點前 3 小時加入[methyl-3H]- Thymidine 0.5~1µCi/mL，再放回培養箱繼續培養。到時間點時，以冰的 PBS 沖 洗後，加入 10% TCA (trichloroacetic acid)在 4℃作用一個晚上，倒掉 TCA 後以 95%酒精沖洗一次，並待酒精自然揮發乾燥，最後加入 0.2N NaOH，在室溫輕微振盪作用 1 小時。從每個 well 中取出 200 mL 加 入 3 mL 的 scintillation cocktail solution(閃爍計數液)充分混合均勻後 放隔夜至透明，即可利用 beta counter 測量其 DPM 值。
四、
細胞毒性測試(MTT assay)
MTT (Methylthiazoletetrazolium)是一種水溶性的 tetrazolium 鹽 類，溶在不含 phenol red 的溶液中呈現黃色。MTT 的 tetrazolium ring 會被細胞內的 dehydrogenase 切除，轉為紫色不溶性沉澱物。使用
DMSO 將細胞打破後，此沉澱物溶解所產生顏色的深淺，代表細胞內 酵素活性的強弱，可當作細胞存活的指標。
人類大腸癌細胞 COLO-205 培養於 6 well 培養盤（約 10,000 顆 細胞/盤）中，生長 24 小時後加入所要試驗的藥物，經特定時間培養，
測試時，在每一 well 中加入 1/10 原有培養液體積的 MTT stock solution (5 mg/ml)作用 4~6 小時，此時若在顯微鏡下觀察，會出現許多深紫色 的針狀結晶。接著以高濃度 DMSO（原液）將細胞打破，再以 ELISA reader 分別測試各組在波長 550 nm 下的吸光值 。
五、
西方墨點法(Western Blot Analysis)
I.萃取細胞蛋白質與蛋白質定量II.蛋白質分析：SDS-PAGE 電泳 III.蛋白質轉印（Protein transfer）
IV.免疫墨點法（immunoblot）
I.萃取細胞蛋白質與蛋白質定量
將大腸癌細胞(COLO-205)養在 10 公分的培養皿中，當細胞長至 約 6~7 分滿時，改以用以不含 FBS 的 RPMI1640 來培養細胞，24 小
時後，再以 10% FBS 的 RPMI1640 含不同濃度的藥物或溶劑（如 mg/mL)與蛋白質樣品分別和 Protein assay dye 容易混合均勻，以分光 光度計(spectrophotometer) 595 nm 測定其吸光值，將 BSA 標準樣品之 吸光值經過計算，作成一條標準回歸曲線，並求得線性方程式，將欲 求蛋白質樣品吸光值帶入公式中，即可求得蛋白質樣品的濃度，最後 將蛋白質樣品保存於-80℃冰箱中備用。
II.蛋白質分析：SDS-PAG 電泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
凝膠配方
Resolving Gel：ddH2O、3M Tris-HCl (PH8.9)、40% Acrylamide、10%
SDS、10% Ammonium Persulfate (APS)、TEMED
Stacking Gel：
ddH2O、1.5M Tris-HCl (PH6.8)、40% Acrylamide、10% SDS、10%
Ammonium Persulfate (APS)、TEMED
先將雙層玻璃洗淨架好，把依照配方泡好的 resolving gel 加入玻 璃中約 2/3，待其凝固後再把上層 1/3 部分加入 stacking gel 並插上 comb 製造凹槽(well)。凝固後將夾有 gel 的玻璃放置在電泳槽中，內 外注入電泳緩衝溶液(PAGE running buffer)，將欲分析的蛋白質樣本 加入 4X SDS/protein loading dye，均勻混合並於 95℃作用 5 分鐘，再 迅速至於冰上冷卻，冷卻後將蛋白質分別加入凝膠上的 well 中，接 海棉及濾紙先放入 towbin transfer buffer 中浸濕，將跑完的 gel 小心去 除上半 stacking gel 的部分，剩下 resolving gel 放入 towbin buffer 中，
取出轉印夾操作轉印步驟，轉印夾由負極到正極依序為海綿→濾紙
→gel→PVDF membrane→濾紙→海綿，確定濾紙和 gel 之間與 gel 和
membrane 之 間 沒 有 氣 泡 存 在 ， 將 裝 置 好 的 轉 印 夾 放 入 轉 印 槽 (Primary Ab)於室溫下均勻作用搖一個小時，至於 4℃作用 overnight，
要換次級抗體前先以 TBST 清洗 5 分鐘 3 次，接著加入次級抗體於 室溫下作用一個小時，最後以 TBST 清洗 5 分鐘至 1 個小時，待作 用完成後加入 ECL 拍照。
六、
免疫沉澱法(Immunoprceipitation)
取 200 µg 的蛋白質萃取液，加入欲抓取蛋白質的抗體(濃度為 2
七、
蛋白激酶活性測定(kinase assay)
(a) Immunoprecipitation準備蛋白質萃取液(200~500 µg)添加欲抓取的抗體(1~2 µg)，再加 入 protein A/G-PLUS agarose(15~20 µg)，於 1mL I.P. buffer 中 4℃均勻 搖晃作用一個晚上。
(b) Wash
以 1000~7000 rpm 離心 30 秒，吸掉上清液，添加 1mL I.P. buffer 上下搖晃幾下，在吸取掉上清液，重複此動作約 3 次，接下來將 I.P.
buffer 換成 kinase buffer，同樣步驟清洗 3 次，最後一次清洗後留下 beads 和 kinase buffer 體積約 20 λ。
(c) kinase reaction
加著加入 20 λ 泡製好的 kinase buffer 內含 1~5 µM cold ATP，
0.1~0.5λ fresh [γ-32P]ATP(5000Ci/mmol) ， 1µg GST fusion protein (Histone 或 RB)當作受質，於 30℃或室溫下均勻作用 20~30 分鐘。
(d)Stop reaction & Separation
之後添加 8 λ 6 倍濃度的 Laemmli’s loading buffer 來終止反應，
以 100℃加熱 10~20 分鐘，然後同樣以西方墨點法 SDS-PAGE 跑電泳。
(e)Autoradiography
以乾燥機將膠去水分乾燥，以 Autoradiography 顯影呈色。
參、實驗結果分析
一、 DPTH-N10 抑制人類大腸癌細胞 COLO-205 的增殖
甲、DPTH-N10 抑制 COLO-205 的[3H]-thymidine incorporation先以 含 有 低 濃 度 胎 牛 血 清 （ 0.04% FBS ） 的 細 胞 培 養 液 對 COLO-205 細胞進行培養 24 小時（starvation 或 quiescence），使大部 份 細 胞 停 滯 在 細 胞 週 期 G0/G1 。 再 以 含 有 0 µM （ 僅 含 有 溶 劑 DPTH-N10 劑量的增加，有漸強的抑制效果（圖三）。同時 COLO-205 的細胞數目也受到 DPTH-N10 的影響而減少，而此抑制作用為可逆 性，當 DPTH-N10 由培養液中移除時則其所造成的生長抑制作用會有 恢復的現象。（圖四）
乙、 DPTH-N10 不會明顯影響 COLO-205 細胞的存活率
由於 DPTH-N10 造成 COLO-205 的[3H] thymidine incorporation
的量減低，有可能是因其使細胞週期的進行發生停滯現象，或是因為 DPTH-N10 影響造成細胞死亡所引起，因此我們以 MTT cell viability assay 來評估 DPTH-N10 對 COLO-205 的細胞存活率的影響。結果如 圖五所顯示，DPTH-N10 在抑制 COLO-205 細胞生長的濃度並不會明 顯影響 COLO-205 細胞的存活率。
綜合甲、乙兩點，DPTH-N10 抑制 COLO-205 細胞的[3H] thymidine incorporation，主要是使細胞週期停滯於 G0/G1 期，而達到抑制細胞
綜合甲、乙兩點，DPTH-N10 抑制 COLO-205 細胞的[3H] thymidine incorporation，主要是使細胞週期停滯於 G0/G1 期，而達到抑制細胞