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蛋 白 質 形 成 RNA 誘 導 沉 默 複 合 體 (RNA-induced silencing complex, RISC)， 而 此 複 合 體 便 可 依 其 所 攜 帶 的 miRNA 與 具 互 補 序 列 的 目 標 mRNA 連 接 ， 並 進 行 其 功 能 。
對 目 標 進 行 切 割 或 抑 制 轉 譯 兩 種 反 應 機 制，取 決 於 miRNA 和 其 目 標 的 互 補 程 度 高 低 1： 若 miRNA 和 目 標 序 列 並 非 完 全 互 補 ， 則 會 抑 制 目 標 基 因 的 蛋 白 質 轉 譯 ； 如 果 和 目 標 mRNA 完 美 互 補 ， 則 會 將 此 段 mRNA 切 斷 (圖 1-1 (b)和 (c))。分 解 mRNA 的 機 制 常 發 生 於 植 物 體 中，
但 大 部 分 哺 乳 動 物 的 miRNA 通 常 則 是 進 行 轉 譯 抑 制 6。且 在 抑 制 轉 譯 的 機 制 中，miRNA 只 會 降 低 目 標 基 因 轉 錄 後 表 現 出 的 蛋 白 質 量，並 且 幾 乎 不 影 響 mRNA 的 數 量 。
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圖 1 - 1 (a) miRNA 的 生 物 合 成 步 驟 。 miRNA 基 因 會 先 在 細 胞 核 中 經 由 RNA 聚 合 酶 Ⅱ 轉 錄 成 較 長 的 初 級 miRNA (pri-miRNA)， 再 被 核 糖 核 酸 酶 Ⅲ 切 割 而 成 為 前 導 miRNA (pre-miRNA) ， 並 被 帶 至 細 胞 質 中 。 接 下 來 Dicer 把 pre-miRNA 切 割 成 約 22 個 核 苷 酸 的 miRNA:
miRNA* 的 雙 股 分 子，並 降 解 miRNA*。脫 離 雙 股 結 構 的 成 熟 miRNA 會 和 多 種 蛋 白 質 形 成 RISC， 而 此 複 合 體 便 可 依 其 所 攜 帶 的 miRNA 與 具 互 補 序 列 的 目 標 mRNA 連 接 ， 並 進 行 其 功 能 。 (b) miRNA 分 解 特 定 mRNA。 (c) miRNA 抑 制 特 定 mRNA 轉 譯 。1 , 6
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圖 1 - 2 植 物 miRNA 對 病 毒 感 染 的 防 禦 機 制 示 意 圖 。 在 植 物 受 病 毒 入 侵 時，已 存 在 於 植 物 體 中 的 miRNA 所 形 成 的 RISC 複 合 體 會 將 互 補 的 目 標 病 毒 mRNA 切 斷 ， 達 成 防 禦 目 的 。
（ b） 癌 症 與 miRNA
miRNA 的 表 現 與 許 多 癌 症 有 相 關 ， 這 些 基 因 被 認 為 是 腫 瘤 抑 制 子 (tumor suppressor) 或 是 致 癌 基 因 (oncogene) ， 近 期 研 究 指 出 ， 絕 大 部 分 人 類 miRNA 位 於 和 癌 症 有 關 的 基 因 組 區 域 內，此 表 示 miRNA 在 癌 症 發 展 的 過 程 扮 演 了 關 鍵 的 功 能 1 0。 身 為 腫 瘤 抑 制 子 的 miRNA 會 因 為 生 物 合 成 的 步 驟 中 產 生 缺 陷 ， 使 得 成 熟 的 miRNA 減 少 而 使 得 目 標 致 癌 蛋 白 不 當 增 生 而 造 成 腫 瘤 的 產 生 。 另 一 方 面 ， 致 癌 的 miRNA 在 不 當 時 間 或 組 織 中 增 殖，會 消 減 miRNA 目 標 腫 瘤 抑 制 基 因 的 表 現 ， 進 而 造 成 癌 症 發 生 。 兩 者 miRNA 失 調 的 結 果 包 含 細 胞 不 正 常 增 殖 、 損 害 增 加 或 新 生 血 管 的 增 生 ， 並 且 降 低 細 胞 凋 亡 及 組 織 的 去 分 化 (圖 1-3)6。 特 定 的 miRNA 失 調 會 造 成 不 同 的 腫 瘤 發 生 ， 例 如 本 論 文 中 所 採 用 的 miR21 在 許 多 腫 瘤 中 皆 有 過 度 增 殖 的 現 象 ， 如 乳 癌 細 胞 ； 而 miR143 和 miR145 在 大 腸 癌 組 織 中 則 是 表 現 量 降 低 11 - 1 3。
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由 於 下 列 因 素 ，miRNA 成 為 理 想 的 癌 症 生 物 標 記 物 ， 來 作 為 偵 測 癌 症 的 有 利 工 具 1 4：
1. 癌 症 組 織 中 ， 特 定 的 miRNA 表 現 量 會 異 常 。 2. miRNA 的 表 現 擁 有 病 症 特 定 性 或 組 織 特 異 性 。 3. miRNA 是 相 對 穩 定 的 分 子 。
圖 1 - 3 (a) 腫 瘤 抑 制 miRNA 在 生 物 合 成 步 驟 產 生 缺 陷 而 造 成 腫 瘤 。 (b) 致 癌 的 miRNA 在 不 當 時 間 或 組 織 中 增 殖 造 成 腫 瘤 的 產 生 。6
(a) (b)
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1-1.2 研 究 動 機 與 實 驗 構 思
於 上 一 節 中 提 到，植 物 受 病 毒 感 染 後，特 定 miRNA 的 量 會 急 遽 增 加 以 進 行 防 禦 機 制 1 5； 此 外 ， 某 些 特 定 的 致 癌 miRNA 明 顯 的 增 加 或 抑 制 腫 瘤 的 miRNA 減 少 ， 皆 會 造 成 人 體 內 的 癌 細 胞 生 成 5。 因 此 ， 本 實 驗 希 望 利 用 偵 測 miRNA 作 為 快 速 診 斷 病 毒 感 染 以 及 癌 細 胞 樣 品 的 方 法 。
在 以 往 偵 測 miRNA 的 方 法 中，常 利 用 的 方 法 為 微 陣 列 (microarray) 或 北 方 點 墨 法 (Northern blot)1 6， 然 而 這 些 技 術 一 般 需 要 較 多 的 樣 品 量 ， 且 還 要 加 入 其 他 反 應 試 劑 ， 提 升 了 實 驗 的 複 雜 度 1 7。 隨 著 奈 米 科 技 的 成 長 ， 發 展 出 擁 有 極 佳 的 靈 敏 度 、 高 度 選 擇 性 、 不 需 標 記 、 以 及 即 時 偵 測 等 優 點 的 矽 奈 米 線 場 效 電 晶 體 (silicon nanowire field-effect transistor, SiNW-FET)，廣 泛 的 應 用 在 生 物 及 化 學 物 種 的 偵 測 上。在 早 期 的 研 究 中，利 用 與 DNA 結 構 類 似 的 中 性 分 子 肽 核 酸 (peptide nucleic acid, PNA)，修 飾 在 矽 奈 米 線 表 面，用 來 偵 測 DNA (如 圖 1-4)，其 結 果 顯 示 此 技 術 可 以 輕 易 的 自 電 訊 號 中 區 分 正 常 以 及 突 變 的 序 列 1 8。
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圖 1 - 4 利 用 微 流 體 通 道 (綠 色 區 域 ) 依 箭 頭 方 向，流 經 SiNW (黃 色 標 記) 表 面 固 定 上 PNA， 以 便 偵 測 特 定 DNA1 8。
接 著 ， 在 另 一 項 研 究 中 ， 將 表 面 修 飾 有 PNA 的 SiNW 作 miRNA 的 偵 測 (圖 1-5)，其 發 現 此 項 技 術 具 有 對 非 互 補 RNA 的 選 擇 性，並 且 指 出 當 DNA 取 代 PNA 作 為 探 偵 時 ， 其 與 RNA 結 合 所 產 生 的 導 電 度 會 明 顯 下 降 ， 原 因 是 DNA 和 RNA 彼 此 的 負 電 荷 所 造 成 的 排 斥 1 9。
圖 1 - 5 在 SiNW 生 物 感 測 器 表 面 修 飾 上 PNA 偵 測 miRNA1 9。
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在 本 論 文 中 ， 雖 然 PNA 的 不 帶 電 性 質 易 於 和 RNA 作 結 合 ， 不 過 其 合 成 成 本 較 高 ， 不 易 作 為 診 斷 的 工 具 ， 因 此 仍 選 擇 DNA 當 作 偵 測 特 定 miRNA 的 探 針 。 此 外 ， 將 DNA 固 定 在 感 測 器 表 面 ， 一 般 會 使 用 APTMS (3-aminopropyltrimethoxysilane) 和 MBS (3-maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimde ester) 修 飾 在 SiNW 上 ， 使 DNA 與 矽 奈 米 線 表 面 以 化 學 鍵 結 固 定 。 然 而 經 上 述 方 式 修 飾 後 的 元 件 只 具 有 一 次 使 用 性 ， 不 但 浪 費 ， 若 將 表 面 完 全 清 除 再 次 修 飾 ， 更 會 傷 害 元 件 。 因 此 在 本 實 驗 使 用 MPTMS (3-mercaptopropyltrimethoxysilane) 取 代 APTMS 的 修 飾，並 改 以 帶 有 硫 醇 基 (thiol group) 的 DNA 作 探 針，使 表 面 與 DNA 之 間 形 成 雙 硫 鍵 (disulfide bond)。 當 偵 測 結 束 時 ， 以 二 硫 蘇 糖 醇 (dithiothreitol, DTT) 分 子 流 經 元 件 表 面 ， 可 將 雙 硫 鍵 切 斷 ， 恢 復 成 硫 醇 基 (thiol group)的 表 面 ， 即 可 再 次 修 飾 新 的 DNA， 繼 續 下 次 的 檢 測 。 因 此 ， 本 論 文 希 望 藉 由 可 重 複 使 用 的 SiNW-FET， 作 為 偵 測 miRNA 的 生 物 標 記 ， 並 可 作 為 診 斷 植 物 致 病 與 癌 症 樣 品 的 有 效 工 具 。
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1-2 以 奈 米 場 效 電 晶 體 作 為 生 物 感 測 器
1-2.1 發 展 簡 史
生 物 定 量 及 分 析 對 於 生 物 醫 學 應 用 與 細 胞 偵 測 極 其 重 要，而 電 化 學 感 應 器 由 於 能 夠 將 生 物 資 訊 直 接 轉 換 成 電 訊 號 ， 使 偵 測 更 為 方 便 且 快 速 ， 因 此 提 供 一 個 絕 佳 的 平 台 來 分 析 生 物 樣 品 中 的 組 成 。 電 化 學 感 測 器 之 材 料 與 方 法 的 研 究 已 歷 經 數 十 年，在 過 去 二 十 年 中，如 量 子 微 粒 、 奈 米 粒 子 、 奈 米 線 、 奈 米 管 和 奈 米 薄 膜 等 奈 米 材 料 已 被 用 於 奈 米 級 感 測 器 的 研 發 中 。 尺 寸 在1 – 100 nm大 小 的 奈 米 物 質 與 核 酸 、 蛋 白 質 、 病 毒 以 及 細 胞 等 生 物 分 子 的 大 小 相 近 (圖 1-6)2 0， 因 此 對 於 這 些 生 物 分 子 所 造 成 的 作 用 會 特 別 顯 著 。 此 外 ， 由 於 這 些 奈 米 物 質 尺 寸 縮 小 ， 而 擁 有 較 大 的 表 面 積 對 體 積 比 (surface-to-volume ratio)， 讓 表 面 的 原 子 決 定 了 物 性 、 化 性 甚 至 是 電 子 性 質 。 再 者 ， 有 些 奈 米 物 質 的 表 面 易 進 行 化 學 修 飾 ， 例 如 矽 奈 米 線 表 面 的 二 氧 化 矽 (SiO2)， 而 適 合 用 於 奈 米 級 感 測 器 的 應 用2 1。
圖 1 - 6 奈 米 物 質 與 生 化 分 子 尺 寸 之 示 意 圖 2 0。
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圖 1 - 7 (a) n型 金 氧 半 場 效 電 晶 體 (NMOS)示 意 圖 。 (b) 奈 米 線 場 效 電 晶 體 (SiNW) 示 意 圖 。
在 本 論 文 中 所 使 用 的 為SiNW-FET， 如 圖 1-7(b) 所 示 ， 其 工 作 原 理 和MOSFET相 似 ， 差 別 在 於 以 矽 奈 米 線 取 代 傳 統 MOSFET的 二 維 材 料 ， 並 可 藉 由 參 雜 (doping) 不 同 的 元 素 來 控 制 通 道 的 載 子 種 類2 2。 由 於 SiNW-FET元 件 具 有 一 維 載 子 通 道 的 性 質，外 界 分 子 在 閘 極 所 施 加 的 電 場 較 能 貫 穿 通 道 ， 而 非 侷 限 在 表 面 的 區 域 ， 因 此 造 成 的 電 場 效 應 會 遠 大 於 二 維 平 面FET。
SiNW-FET有 兩 種 主 要 製 程 方 法 ， 分 別 是 由 上 至 下 (top down) 和 由 下 到 上 (bottom up)， 如 圖 1-8所 示2 1。Top-down的 方 法 是 藉 由 黃 光 顯 影 (lithographic) 技 術 結 合 電 子 束 (electrom beam) 蝕 刻 來 定 義 SiNW-FET；而 bottom-up則 是 先 合 成 矽 奈 米 線 後，再 經 由 光 顯 影 或 電 子 束 顯 影 法 來 合 成 電 極 並 完 成 元 件 。
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圖 1 - 8 (a) Top-down 製 程 流 程：(i) 在 矽 層 摻 雜 低 密 度 的 硼 或 磷；(ii) 以 光 罩 定 義 電 極 位 置，並 高 度 摻 雜 於 此 區 域；(iii) 以 RIE 蝕 刻 出 微 米 級 的 電 極 ；(iv) 以 電 子 束 蝕 刻 晚 成 奈 米 級 SiNW。
(b) Bottom-up 製 程 流 程 。 (i) 以 CVD-VLS 機 制 合 成 SiNW； (ii) 將 SiNW 鋪 於 晶 片 表 面 ； (iii) 光 罩 定 義 出 電 極 位 置 ； (iv) 熱 蒸 鍍 沉 積 金 屬 於 晶 片 表 面 ；(v) PG remover 除 去 光 阻 完 成 電 極 。2 1
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1-2.2 應 用 與 發 展
如 何 有 效 率 及 穩 定 的 將 生 化 分 子 與 奈 米 元 件 整 合 為 一 重 要 議 題 ， 而 SiNW-FET 可 以 利 用 共 價 鍵 (covalent bond) 或 是 靜 電 作 用 力 (electrostatic force) 等 固 定 化 技 術 ， 將 生 物 受 體 (receptor) 修 飾 在 矽 奈 米 線 表 面 ， 接 著 利 用 分 析 物 本 身 所 帶 的 電 荷 作 為 閘 極 電 壓 ， 即 可 進 行 免 標 記 、 高 靈 敏 度 及 高 選 擇 性 的 即 時 偵 測 。 近 年 來 ，SiNW-FET 已 成 功 廣 泛 運 用 於 蛋 白 質 間 交 互 作 用 的 偵 測、DNA 雜 交 研 究、檢 測 生 物 體 之 病 毒 感 染 、 監 控 腫 瘤 細 胞 、 即 時 記 綠 神 經 細 胞 電 訊 號 等 ， 而 SiNW-FET 的 發 展 也 達 成 可 重 複 使 用 的 目 的 ， 並 且 設 計 出 三 維 的 SiNW-FET。 接 下 來 將 分 別 介 紹 SiNW-FET 的 應 用 與 發 展 。
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1. 蛋 白 質 間 的 交 互 作 用
一 般 蛋 白 質 間 的 結 合 常 數 (association constant, Ka) 約 在 106-109 M- 1， 較 抗 體 與 抗 原 結 合 之 Ka＞109 M- 1 要 微 弱 的 多 ， 而 不 易 測 量 ， 因 此 希 望 發 展 出 一 個 快 速 且 能 準 確 檢 測 蛋 白 質 間 交 互 作 用 的 方 法 。 近 年 研 究 發 展 出 可 重 複 使 用 的 SiNW-FET， 作 為 蛋 白 質 交 互 作 用 的 偵 測 平 台 ， 其 方 法 將 鈣 調 素 (calmodulin, CaM) 修 飾 在 矽 奈 米 線 表 面 ， 偵 測 鈣 離 子 及 可 和 CaM 作 用 的 蛋 白 質。結 果 (圖 1-9) 說 明 利 用 SiNW-FET 可 證 明 系 統 具 有 選 擇 性 CaM 與 N-型 閘 門 鈣 離 子 通 道 (voltage-gate Ca2 + channel, VGCC) 有 直 接 交 互 作 用，此 外，研 究 中 還 利 用 穀 胱 甘 肽 (glutathione, GSH) 與 穀 胱 甘 肽 轉 移 酶 (glutathione S-transferase, GST) 之 可 逆 結 合 性 質 ， 將 SiNW-FET 重 複 使 用 以 提 高 其 實 用 性 2 4。
圖 1 - 9 利 用 SiNW-FET 偵 測 CaM 與 離 子 及 N-型 VGCC 之 交 互 作 用。
(a) N-型 VACC 經 細 胞 表 現 與 純 化 後 ， 導 入 SiNW-FET 量 測 。 (b-c) N-型 VACC 與 CaM 結 合 之 電 訊 號 圖 。2 4
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2. DNA 雜 交 研 究
除 了 針 對 蛋 白 質 間 交 互 作 用 的 研 究 ，SiNW-FET 亦 可 作 為 DNA 或 RNA 的 檢 測 工 具。由 於 DNA 或 RNA 的 磷 酸 骨 架 帶 有 大 量 的 負 電 荷 ， 可 利 用 感 應 電 場 作 偵 測 ， 使 SiNW-FET 成 為 檢 測 DNA 或 RNA 很 有 力 的 工 具 。 肽 核 酸 (peptide nucleic acid, PNA)是 一 種 與 DNA 相 似 的 人 工 合 成 聚 合 物 ， 常 用 於 生 物 研 究 ， 特 別 是 在 DNA 或 RNA 的 雜 交 上 。 由 於 PNA 不 具 有 帶 電 的 磷 酸 骨 架 ，使 PNA-DNA 或 PNA-RNA 間 沒 有 電 荷 的 排 斥 力 ， 結 合 能 力 比 起 DNA-DNA 或 DNA-RNA 來 的 更 大 。 在 圖 1-10 中 的 研 究 將 PNA 修 飾 於 p-型 SiNW-FET 表 面 來 做 免 標 記 的 DNA 即 時 偵 測， 由 於 DNA 帶 負 電 荷 的 磷 酸 骨 架，可 使 PNA-DNA 結 合 後 導 電 度 明 顯 增 加 2 5。
圖 1 - 10 (a) PNA 與 DNA 結 合 示 意 圖 。 (b) 實 驗 裝 置 。2 5
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3.腫 瘤 檢 測
生 物 標 誌 物 (biomarker) 是 可 用 作 指 出 特 定 疾 病 或 生 物 體 的 生 理 狀 態 的 生 物 分 子 ， 因 此 偵 測 特 定 生 物 標 記 物 可 作 為 某 些 疾 病 的 篩 檢 。 然 而 這 類 生 物 標 記 物 在 血 液 中 的 濃 度 極 低 ， 因 此 臨 床 檢 驗 上 須 要 能 夠 快 速 且 精 準 的 診 斷 方 式 。 近 年 有 研 究 設 計 陣 列 形 式 的 SiNW-FET 以 同 時 檢 測 多 種 腫 瘤 標 誌 物 ( 圖 1-11) ， 其 由 修 飾 三 種 不 同 抗 體 的 SiNW-FET 元 件 組 成 ， 且 對 應 的 三 種 抗 原 皆 為 臨 床 診 斷 的 腫 瘤 標 記 物 ， 分 別 為 前 列 腺 特 異 性 抗 原 (prostate specific antigen, PSA)、 癌 胚 抗 原 (cancinoembryonic antigen, CEA)以 及 粘 蛋 白 -1 (mucin-1)。 當 有 對 應 的 抗 原 與 抗 體 結 合 時 ， 會 造 成 SiNW-FET 的 導 電 度 改 變 ， 即 表 示
生 物 標 誌 物 (biomarker) 是 可 用 作 指 出 特 定 疾 病 或 生 物 體 的 生 理 狀 態 的 生 物 分 子 ， 因 此 偵 測 特 定 生 物 標 記 物 可 作 為 某 些 疾 病 的 篩 檢 。 然 而 這 類 生 物 標 記 物 在 血 液 中 的 濃 度 極 低 ， 因 此 臨 床 檢 驗 上 須 要 能 夠 快 速 且 精 準 的 診 斷 方 式 。 近 年 有 研 究 設 計 陣 列 形 式 的 SiNW-FET 以 同 時 檢 測 多 種 腫 瘤 標 誌 物 ( 圖 1-11) ， 其 由 修 飾 三 種 不 同 抗 體 的 SiNW-FET 元 件 組 成 ， 且 對 應 的 三 種 抗 原 皆 為 臨 床 診 斷 的 腫 瘤 標 記 物 ， 分 別 為 前 列 腺 特 異 性 抗 原 (prostate specific antigen, PSA)、 癌 胚 抗 原 (cancinoembryonic antigen, CEA)以 及 粘 蛋 白 -1 (mucin-1)。 當 有 對 應 的 抗 原 與 抗 體 結 合 時 ， 會 造 成 SiNW-FET 的 導 電 度 改 變 ， 即 表 示