1) 免疫系統及巨噬細胞的活化
人體藉由免疫系統對抗外來微生物抗原入侵，而免疫系統又可以 分為先天性免疫 (innate immunity)和後天性免疫 (adaptive
immunity)；當器官或組織受到損傷時，兩者可以在不同的階段互相
的結合與作用。先天性的免疫包括一些天然的屏障來阻隔外來物的入 侵，並且會持續不斷的監視體內各種外來入侵物。在遇到像是LPS這
樣的病原時就會形成即時的發炎反應，阻止大部分的病原威脅。與先 天性免疫有關的細胞中 (包括macrophage、monocyte等等)，對於遭遇
外來病原的威脅時有一個很重要的功能，是產生與發炎反應有關的媒 介物，諸如cytokines、 chemokines、 nitric oxide 及 reactive oxygen species。
發炎反應對於身體而言是很重要的，如果沒有有效的發炎反應，
將可能導致生物體更大規模的感染甚至其與癌症的形成有關。然而過 度的發炎反應卻也有可能使一些疾病日形惡化導致生物體死亡，例 如，rheumatoid arthritis (RA)，Crohn’s disease，atherosclerosis，
diabetes，Alzheimer’s disease，multiple sclerosis，以及 cerebral and myocardial ischaemia (1).
Lipopolysaccharide (LPS)是一種存在於 Gram negative 細菌細胞
壁的內毒素(Endotoxin)。當人體在受到細菌入侵、感染後，monocyte 或macrophage 會透過細胞表面 Toll-like receptor (TLR) family 中 TLR4 所引發的訊息途徑產生inflammatory cytokines 並且活化 (activate)，
進一步去對innate immunity 做出回應。活化之後的 macrophages 能夠 移行 (migration)到發炎的病灶，藉由吞噬作用 (phagocytosis)來清除
病原。另一方面，在macrophages 表面，LPS 與 LPS binding protein (LBP) (2)結合後，就會被 TLR4 與 CD14 所形成的複合體辨識，而使得 TLR4 在細胞內的部分靠著MyD88 dependent 或 TRIF 的 pathway 來活化下 游的許多訊息傳遞途徑，包括轉錄因子NF-κB 及 MAPK pathway，進 而控制與發炎反應相關的基因表現 (3)。過去的研究指出，
MyD88-deficient mice 在遇到 LPS 這樣的病原時，並無法表現出發炎
相關的cytokine (例如 TNF-α) (4)，此一結果顯示出 TLR-MyD88 pathway 對遭遇病原入侵的細胞產生發炎反應是必需的。而和發炎相
關的cytokines 可以使得免疫系統發揮安全防護機制，避免外來物質 對生物體的危害。
2) Cytokines 及 IL-6
免疫系統和血液系統中細胞的分化和成長是受到cytokines 或 interleukins (ILs)的調節。這些 cytokines 的其中一個特點是有著重複
性的功能。例如，一種cytokine 對於許多不同的細胞或組織有著很廣 泛的生物功能，而其它不同的cytokines 也可以在特定的細胞上表現 出相似且重疊的作用。IL-6 就是這種典型的多功能 cytokine。
IL-6 最初是以 B cells stimulating factor (BSF) 的形式被發現，並 且能夠促進漿細胞的分化 (5)。在許多不同 stimuli 的剌激之下，
professional APC (Antigen Presenting Cell)可以快速的產生及釋出 IL-6。 IL-6 可以像 IL-12 一樣去導致 naïve CD4 T cell 分化，進一步 使naïve CD4 T cell 成為成熟 T cell。先前的文獻指出，IL-6 也可以調 節處於Th1/Th2 平衡狀態的細胞群走向 Th2 的細胞分化 (6)。有趣的 是，一些研究中顯示，在感染的過程中，如果缺少 IL-6 會使得 T cell 沒有辦法進入受感染的肺部中，因此IL-6 被認為跟活化的 T 細胞的 移行作用有關 (7)。另外，在 in vitro 的實驗中，IL-6 似乎是藉由維持
細胞內Bcl-2 蛋白質的表現，而使得 CD4 T 細胞的生存延長，因此被 認為具有抵抗細胞凋亡的功能 (8)。
通常在一般的情形下，IL-6 是不會表現的，當處於許多自體外的
剌激時，例如細菌性或病毒性的病原感染，IL-6 可以透過訊息傳遞被
包括了Macrophage，T 與 B 淋巴球在內的許多細胞所分泌。另外，
透過IL-6/gp130 signaling ，IL-6 也能調節自身的合成 ( 9 ; 10)。
IL-6 的缺乏的確會導致一些免疫方面的現象與疾病，包括對於細
菌和病毒的抵抗力減少 (11) ，使周邊循環系統的 T cell 數量下降與 leukocyte 移動到發炎地方的能力下降 (12)，但另一方面卻也可以使 得一些急性發炎反應 (Acute Phase Response, APR)減低。另外，在使 用了IL-6 knockout mice 所做的實驗顯示出，在缺乏 IL-6 的存在下，
對於一些和發炎反應相關的代謝疾病有著重大的影響，例如在 cartilage destruction 中 IL-6 扮演著的關鍵性角色，間接影響
Antigen-induced Arthritis (AIA)的形成，使得阻斷 IL-6 的藥物開發成 為治療AIA 的一個方向 (13)。在某些研究甚至把 IL-6 視為內分泌系
統的一部分，並且暗示著IL-6 對於中樞神經系統的發展及相關病理
扮演著重要的角色 (9)。
近年來有許多關於癌症方面的研究指出，IL-6在細胞處於發炎環
境時，會促使細胞漸具癌化徵象，使得發炎反應與癌症產生連結。實 驗動物模式中，IL-6的分泌對於肝臟受損受後的hepatocyte
proliferation 和 liver regeneration 是必需的，但是卻也提高了肝細胞 癌化的危險 (14 ; 15)。
3) Nitric Oxide 及 iNOS
一氧化氮(NO)是一種常見的氣體，可以經由許多包括發電廠、汽 車引擎等產生，為主要的大氣汙染源之一。然而在生物體中，NO 卻
是重要的訊息傳遞分子。在包括許多生理、病理的疾病病程中，NO 的訊息通常在哺乳動物的體內可以是有益的，也有可能是有害的 (16)。適當的 NO 表現對於器官的保護作用是重要的，例如肝臟的 ischemic damage。可是，持續產生的 NO 卻會導致直接造成組織的傷
害並且引發與Septic shock 有關的血管萎縮。文獻中也指出，慢性的 NO 表現與許多的 carcinoma 及發炎有關，甚至包含了成年糖尿病、
多重壞死、關節炎、大腸潰瘍在內的一些疾病 (17)
1980 年代 Furchgott, Ignarro, 與 Murad 等人的發現說明了為何
acetylcholine 可以導致血管的擴張，他們的研究結果使得原本在大氣 中被視為汙染源的一氧化氮成為了治療人類一些重大疾病的大功
臣，而這三位科學家也因而榮獲1998 年的諾貝爾生理醫學獎的殊
榮。他們指出，在血管中的內皮細胞會利用nitric oxide synthase (NOS) 來將L-arginine 轉為 citrullin 及 NO。藉由血管內皮細胞 NO 的產生使 周邊的平滑肌得以放鬆，進而使血管擴張及血流量增加。
NO 也可以被 phagocytes 所產生，包括了 monocytes、macrophages
和neutrophils 在內，NO 對於免疫系統的影響目前正熱烈地被探討。
而在phagocyte 中，NO 主要是由 iNOS ( inducible NOS)所催化形成。
iNOS 正如其名，主要是由外來的剌激所產生。NOS 是一系列能產生 NO 的酵素，共有三種 isoforms，並分別由三個獨立的基因所 encode
(17)。除了 iNOS 以外，其它兩種 isoform 是呈穩定性表現的
(constitutive expression)，並且其活性為 calcium-dependent，分別為 brain constitutive NOS (NOS1, nNOS)及 endothelial constitutive NOS (NOS3, eNOS) (18)。雖然名稱顯示出它們最初被發現的器官或組織，
但是這兩種NOS 後來也被發現可以表現在其它組織的細胞中。iNOS
是calcium-independent，並且會隨著時間的增加而分泌大量的 NO；
所產生的NO 可以活化 soluble guanylate cyclase (sGC)，進而將 GTP 轉化成cyclic guanosine monophosphate (cGMP)，活化包括
cGMP-dependent protein kinases (PKGs)在內的下游標的蛋白 (19)，使
得NO 間接的參與一些包括 smooth muscle relaxation、platelet function regulation、sperm metabolism、cell division、和 nucleic acid synthesis 在內的重要生理作用。
4) Src Family Kinases 及 Src 參與巨噬細胞的活化
Src family kinases (SFKs)是一群結構類似的 nonreceptor tyrosine kinases。早期 J. Michael Bishop 和 Harold E. Varmus 對於致癌基因的 研究中，使用了變異的 Rous retrovirus 來探討在正常細胞與癌化細胞 中oncogene 的影響，進而發現了 src 基因，並因此獲得 1989 年的諾 貝爾生理醫學獎。
SFK有九個成員，包括了Src，Blk，Lyn，Fgr，Hck，Lck，Yes，
Fyn和Lyk。從免疫細胞到其它血液相關的細胞，SFKs在複雜的訊息 傳遞中皆扮演著重要的角色 (21 ; 21)，使得細胞得以進行移行作用、
細胞增生等等的生理作用。在血液細胞中，SFKs在不同種類的細胞 之內都會有不同程度的表現 (22) ；例如，在macrophages中主要表現 的為Lyn、Fgr及Hck。
近年來另一個廣泛被研究的重點是SFKs對於macrophage移行作 用的影響。早期，由Jan Bohuslav等人探討人體monocytes與
chemoattractant的關係指出，Lyn、Fgr、Hck、Fyn會在受到外來的剌 激之後有著顯著的表現，這些tyrosine phosphorylation的大量表現意味 著在受到chemical agent的剌激之時，有著調節monocyte移行的作用 (23)。之後陸陸續續有著許多的研究來探討Src family kinases對於細胞 移動性的影響，並且都認為上述的這些SFKs (Hck，Lyn，Fgr)磷酸化 的大量表現對於從巨噬細胞活化到cytokine的分泌中扮演著重要的角 色(24; 25; 26)。直到Meng F.和Lowell CA.的實驗室使用了Hck-/-， Fgr-/-，Lyn-/-的triple knockout mice並抽取其peritoneal macrophage實驗 的結果，顯示出上述這三種SFK其實在macrophage的活化及cytokine 產生中並不是絕對必需的tyrosine kinases，這使人懷疑是否有著其它 的SFK參與或與這三種SFK有著互補的作用 (27)。 到了2006年一篇
探討LPS引發macrophage活化的文獻中指出，對於巨噬細胞的活化、
一氧化氮的分泌及cytokine的表現，c-Src可能參與了其中的訊息傳遞 機制 (28)。Dr. M.C. Maa等人更在2008年完整闡述了iNOS及其下游的 pathway對由LPS引起的macrophage migration而言是重要的，而Src在 這條pathway中又扮演著關鍵性的角色 (29)。
除了Src 之外，學者也發現，Lyn 與 myeloproliferation和自體免 疫的關係 (30)。還有Lyn、Fgr、Hck在leukocyte中對於integrin beta-2 signal transduction的影響 (31)等等, 一再的顯示出SFKs對於免疫系 統所扮演的不可或缺的角色。
5) MAPK Pathway 與 ERK Kinase 及其下游途徑
Ras/Raf/MEK/ERK pathway，又稱MAPK pathway，是由細胞表 面到細胞核藉由一系列蛋白質磷酸化的訊息傳遞過程 (32)。一開 始，受到細胞外面的stimuli剌激時，包括受到growth factor 引發的 receptor tyrosine kinases (RTKs)在內，Ras會和GTP結合而被活化，接 著，Raf因此從細胞質中被轉移到細胞膜下，並且可能受到Src family kinases (SFKs)的作用而活化 (33; 34)。活化後的Raf會引起MAP kinase extracellular signal regulated kinases 1/2 (MEK1/2)的磷酸化，進而使 extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK1/2)上面Thr及Tyr
residues的磷酸化 (35;
36; 37)。活化後的ERK轉移到細胞核中，並磷
酸化一些轉錄因子 (例如：Elk-1、Myc、CREB、Fos等等)使其結合 到許多基因的promoter上，導致像是growth factor及cytokines的表現，使得細胞得以進行分化 (differentiation)、增生 (proliferation)等等。
第二章 實驗材料與方法 (Materials and Methods)