第 3 章 結果 (RESULTS)
3.1 挑選臺大醫院對環丙沙星 (ciprofloxacin) 耐受性之臨床菌株
本實驗所使用之菌株，由台大醫院內科楊智欽醫師提供，共有 15 株經過 初步分析，具有 ciprofloxacin (CIPRO) 耐受性之菌株 (表 1)。根據臨床與實驗室 標準協會 (clinical and laboratory standards institutes，CLSI) 於 2009 年所公布的 標準，幽門螺旋桿菌對於 Ciprofloxacin 的最小抑菌濃度 (minimum inhibitory concentration, MIC) 在 1 μg/ml 以下為感受型 (susceptible)，濃度介於 1-4 μg/ml 之間為中間型 (intermediate)，濃度 4 μg/ml 以上定義為抵抗型 (resistant)。從 中挑選 002、003、006、009 與 011 共 5 株，在本實驗中分別以 NTUH-CIP2、
NTUH-CIP3、NTUH-CIP6、NTUH-CIP9 與 NTUH-CIP11 為命名，此 5 株經初步分析 為未有 QRDR 區域胺基酸改變，前三株 CIPRO MIC 8μg/ml、後兩株 CIPRO MIC 2μg/ml 的環丙沙星抵抗型菌株;另也挑選 001 (NTUH-CIP1)，為 QRDR 上胺基酸改 變的抗藥菌株，以此做為之後實驗的對照組。
3.2 4 株臨床菌株之環丙沙星感受性詴驗 (antimicrobial susceptibility testing)
為了以利後續實驗的進行，我們依照 CLSI 的方法利用瓊脂稀釋詴驗 (agar transformation) 與 gyrA 片段的定序分析，以確定所挑選的菌株本身抗藥性並非23 質體並分別滴至 ciprofloxacin 感受型菌株 Helicobacter pylori 26695，培養一天後 再 塗 盤 至 ciprofloxacin 4μg/ml 的 培 養 基 做 篩 選 ， 篩 選 結 果 ( 表 2) 發 現 NTUH-CIP1 與 NTUH-CIP2 的 gyrA 送至 Helicobacter pylori 26695 後，使得原為藥 物感受型菌株轉為 ciprofloxacin 抵抗型菌株，而 NTUH-CIP3、NTUH-CIP6 與 NTUH-CIP11 無法使感受性菌株得到 ciprofloxacin 抗藥性。而 4 株抗藥菌株之 gyrB TA 載體經轉型後，並不會使 Helicobacter pylori 26695 獲得抗藥性。
之後將 NTUH-CIP1 與 NTUH-CIP2 的 gyrA 送定序分析，結果再與 26695 gyrA
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CIPRO 抗藥性。最後確認 CIPRO MIC 分別為 8 與 2 μg/ml 的 NTUH-CIP3 與 11，
兩株於 gyrA QRDR、gyrA 及 gyrB 序列上並沒有影響環丙沙星感受性的胺基酸變 異，因此之後的實驗挑選 CIPRO MIC 8 μg/ml 的 NTUH-CIP3 做為主要研究菌株。
3.4 建構表現基因庫 (construction of a expression library)
為了探討可能的抗藥機制，因此建構幽門桿菌表現基因庫進行篩選，為了 能篩選出 NTUH-CIP3 環丙沙星抗藥基因的完整開放閱讀架 (Open Reading Frame, ORF)，因此回收限制酶酵解後細菌基因體的 3-5 kb DNA 片段大小。
3.4.1 基因體 DNA 的部分酵解與 3-5 kb DNA 片段回收
將 NTUH-CIP3 的 genomic DNA 以不同稀釋濃度的 Sau3AI (5U/μl) 進行部份 酵解 (partial digestion)，並以電泳方式觀察不同酵素濃度及反應時間，挑選適 當條件，最後挑選 10 倍稀釋的 Sau3AI (0.5U/μl) 進行酵解反應 20 分鐘條件 (圖
利用 λ-ZAP Express Predigested Gigapack Cloning Kit 來構築表現基因庫。將 幽門螺旋桿菌基因體經過部分酵解後並回收 3-5 kb 的片段大小，將其與 λ-ZAP 載體做連接作用 (Ligation)，再以套組內的 packaging extracts 組裝成噬菌體。初 步組裝完成後的菌體懸浮液必頇完成定量 (Titering)，且定量所得到的透明溶菌 斑 (即有成功接入細菌酵解後的片段) 以達到 1×106pfu/μg of vector (per μg of
-ZAP II Express Vector，為接合作用參與反應的 vector 含量) 以上為佳，而藍色
溶菌斑 (即未接入細菌酵解後片段) 需小於 1 x 105 PFU/μg of vector 才符合套組 所建議之理想表現基因庫的涵蓋程度，若組裝後的透明溶菌斑數量過低，即表 示此表現基因庫的涵蓋度偏低，也意味著此基因庫代表性不足。25
N=Primary Recombinants，即所需的 clone 數量
P=基因庫得涵蓋百分比，此處期望涵蓋百分比達 99%，P=0.99
3.4.3 篩選表現基因庫 (screening the expression library)
前述所構築的幽門螺旋桿菌表現基因庫會利用大腸桿菌 XLOLR 來表現，此 Ciprofloxacin 有抵抗性的大腸桿菌 XLOLR 菌株。
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經由篩選得到的 16 個菌落，經由三次瓊脂稀釋詴驗法確認其對環丙沙星 的最低抑菌濃度，結果發現，16 株的最小抑菌濃度均相較於比較組的大腸桿菌 XLOLR (0.03125-0.0625 μg/ml)，至少有 4 倍以上的提升 (CIPRO MIC≧0.25μg/ml) (表 7)，之後萃取這些菌落質體進行再次轉型作用。
3.4.4 篩選後菌株之再次轉型作用 (retransformation of selected strains)
為了確認所篩選出的菌株所帶的 Insert 片段確實在抗藥過程扮演重要的角 色，並排除因環丙沙星為篩選標準所誘發大腸桿菌 XLOLR 基因體上 QRDR 的胺 基酸突變，導致環丙沙星的抗藥性，我們進一步利用再次轉型作用，將前述篩 選自表現基因庫中對環丙沙星抗藥性增加的大腸桿菌 XLOLR 16 株 (表 7)，抽取 內部質體後，轉型至環丙沙星敏感性的大腸桿菌 XLOLR 內，之後檢測這 16 株 質體轉型後的大腸桿菌 XLOLR 的最低抑菌濃度，結果發現其中 3 株最低抑菌濃 度確實提升 2-4 倍。
3.4.5 DNA 序列分析 (DNA sequencing analysis)
將上述經由再次轉型作用後 MIC 提升的 3 株菌株，抽取其質體，利用質體 上的 T3 與 T7 引子做聚合酵素連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction)，確認三株 質體的內插片段大小 (圖 5)，由此排除此三質體為同一質體來源。之後利用定 序 分析 得到質體插入 片段的 DNA 序列，再利用 NCBI (national center for biotechnology information) 網站內的 BLAST (basic local alignment search tool) 系 統，將質體插入片段 DNA 序列與系統資料庫內已發布的生物序列做比對，結果 發現三株質體的 DNA 插入片段均比對到已知完整基因體序列 Helicobacter pylori 26695 與 J99 的 oor 基因組 (圖 6)。oor 為 2-oxoglutarate-acceptor oxidoreductase，
主要功能會將電子傳遞至 NADP 的氧化還原酶，也被認為在 acetyl-CoA 轉換成 succinyl-CoA 過程中主要參與的分子之一[32]。
27 自然轉型作用送入 quinolone 感受型菌株 Helicobacter pylori 26695，再分別利用 兩倍序列稀釋的環丙沙星濃度篩選轉型後的感受型幽門螺旋桿菌，若在此兩種 (ribosome) 結合位置 Shine-Dalgarno 區域的序列[30]，我們比對 NTUH-CIP3 與環 丙沙星感受性菌株 J99 與 Helicobacter pylori 26695 gyrA 前端 100 bp 包含前述啟 動子區域的序列，結果發現，有 7 個位置具有核甘酸的多型性 (polymorphism)，
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the resistant strain by two dimensional gel electrophoresis )
前述利用表現基因庫無法順利篩選到參與環丙沙星抗藥機制的基因，此外
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激前後表現量相差 4 倍以上的 38 個點 (圖 9、10)，經由挖點、膠內水解 (In gel digestion) 及介質 輔助雷 射 脫附離 子 化質譜 法 (MALDI Q-TOF) 得 到 MS 與 MS/MS 數據，最後經由電腦進行胜肽質量指紋 (peptide mass fingerprint，PMF) 與 MS/MS 離子搜尋 (MS/MS Ion Search) 分別比對 NCBInr 與 SwissProt 兩蛋白質 資料庫，總共比對出 12 個蛋白質，其中分別有 5 個點與異戊二烯 (isoprenoid) 的 合成和檸檬酸循環 (TCA cycle) 有關；2 個點具有甲基化 (Methylation) 功能的 甲基轉移酶 (Methyltransferase)；5 個點為假設性蛋白 (hypothetical protein) (表 9、10)。另外有 3 個點可能因外來汙染與內含蛋白質含量過低而比對到 keratin (角質蛋白)，其他 23 個點雖然有比對到蛋白質，但經過資料庫統計後的可性度 不足。
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第4章 討論 (Discussion)
4.1 表現基因庫的基因涵蓋度與篩選
本實驗利用幽門螺旋桿菌的基因體隨機做部分酵解、構築表現基因庫，再 送入至大腸桿菌 XLOLR 內表現，之後雖然利用一般統計學公式估算此基因庫涵 蓋度，其估算結果與實際涵蓋度仍然有一定的差距，即使估算數值雖達到 99.99% 以上，計算公式也無法排除構築過程中實驗或人為的疏失，或是菌株間 本來存在的差異等等，故估算值也僅能提供初步評估此表現基因庫的代表性。
本實驗所構築之表現基因庫篩選到 16 株 CIPRO MIC 上升之大腸桿菌菌株，之後 抽取質體作再次轉型作用，將質體送至不帶有質體之大腸桿菌 XLOLR 內，最終 檢測只有 3 株大腸桿菌 XLOLR 有 CIPRO MIC 上升的表現型，其他的 13 株大腸桿 菌 XLOLR 可能因為利用環丙沙星大量篩選表現基因庫，誘發大腸桿菌 XLOLR 基 因體上 QRDR 的胺基酸突變所致。
CIPRO MIC 上升的 3 株質體，實驗結果發現其質體內含的 insert 片段不同，
屬 3 個不同的 clones，且均包含 oorA 基因，在大腸桿菌系統大量表現下，確實 可以使 MIC 上升 2-4 倍，但此現象卻無法於幽門螺旋桿菌系統中表現，以下探 究可能的幾項原因影響本表現基因庫所得到的篩選結果以及此基因庫本身篩選 之限制:。
1. 由於 pBK-CMV 本身帶有很強的 promoter 或載體本身能夠於大腸桿菌達到 一定的複製數目 (copy number)，造成一定程度的基因被大量表現，以致於 大腸桿菌的系統中 CIPRO MIC 上升，但此載體並不會於幽門螺旋桿菌內複 製，可能因此使得基因表現不足以讓我們觀察到 CIPRO MIC 的變化。
2. 抗藥機制並非為單一基因所調控。表現基因庫主要用於篩選單一基因所能 調控的表現型 (phenotype)，經由表現型的改變或菌株抗藥性的產生來做為 篩選指標，若此臨床菌株抗藥性表現並非單一基因的調控，而是多基因間
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但結果兩者間存在約 5 倍的顯著表現量差異。原假設 NTUH-CIP3 與 NTUH-CIP11
32 (Methylation) 功能的甲基轉移酶 (Methyltransferase)，詳細請參考表 9、10。
4.3.1 甲基丁四醇磷酸化路徑 (methylerythritol phosphate (MEP) pathway) 與代 謝作用的調控 (metabolic regulation)
2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) cytidylyltransferase 主要參與在甲 基丁四醇磷酸化路徑 (methylerythritol phosphate (MEP) pathway) 中合成中間 產物 CDPME (4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol)(圖 11)。大部分的細菌多 以甲基丁四醇磷酸化路徑 (MEP pathway) 路徑來合成烯焦磷酸 (Isopentenyl diphosphate，IPP) 與二甲基丙烯二磷酸 (dimethylallyl diphosphate，DMAPP)，
這兩個產物是組成異戊二烯化合物 (isoprenoid) 的基本骨架，在細菌體當中此 化合物為組成細胞膜結構 (如革蘭氏陰性菌內外膜成分 hopanoids)，電子傳遞 鏈 (如 qinones) 與蛋白質合成 (tRNA 上的修飾) 等扮演重要的角色[34][36]。
果糖二磷酸醛縮酶 (fructose-bisphosphate aldolase，FBP-aldolase) 則參與 在醣解作用 (glycolysis) 的過程中，最後將醣類分解為丙酮酸 (pyruvate) 與甘 油三磷酸 (D-glyceraldehyde 3-phosphate)，兩產物除了作為檸檬酸循環的前驅 產物外，在細菌體中也是合成異戊二烯化合物的最初原料 (圖 11)。兩蛋白質在
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受到環丙沙星刺激之後，表現量為均上升[35]。
另外三個蛋白質經分析後發現均參與在糖解作用 (glycolysis) 到檸檬酸循 環 (citric acid cycle) 的路徑當中；受到環丙沙星刺激之後的 NTUH-CIP3 菌株，
乙醯輔酶 A 合成酶 (acetyl-coenzyme A synthetase) 與雙稀內酯水解酶家族蛋白 (dienelactone hydrolase family protein) 兩者蛋白質表現量下降；蘋果酸脫氫酶 (malate dehydrogenase，MDH) 的蛋白質表現量上升。功能如下 (圖 11):
1. 乙醯輔酶 A 合成酶的作用位置，於糖解作用末端、進入檸檬酸循環之前，
主要能利用 ATP 將醋酸 (Acetate) 轉換為乙醯輔酶 A (acetyl-coenzyme A)、
二磷酸 (Diphosphate) 與單磷酸腺苷 (AMP)，之後以乙醯輔酶 A 的形式進入 檸檬酸循環[35]。
2. 雙稀內酯水解酶家族蛋白主要參與在 β-ketoadipate pathway，主要被發現存 在於細菌以及黴菌兩類，此類水解酶能代謝具毒性的芳香族化合物，雙稀內 酯水解酶 (dienelactone hydrolase，DLH) 能夠將其轉化為無毒性的檸檬酸循 環原料乙醯輔酶 A 與琥珀酸輔酶 A (succinyl CoA)。[36]
3. 蘋果酸脫氫酶作用於檸檬酸循環內，能夠將蘋果酸 (Malate) 與 NAD+轉換為 草醯乙酸 (Oxaloacetate) 並且釋放出 NADH。[35]
4.3.2 甲基化作用 (methylation)
另比對到 2 個蛋白質均具有甲基化功能的甲基轉移酶 (Methyltransferase)，
分別為 tRNA 5-methylaminomethyl-2-thiouridine biosynthesis bifunctional protein MnmC 與 chemotaxis protein methyltransferase，兩者均能將 AdoMet (s -腺苷甲 硫氨酸，S-adenosylmethionine) 上所帶有的甲基轉移至另一個基質上。
1. 在 大 腸 桿 菌 中 ， mnmC 能 將 甲 基 轉 移 修 飾 至 tRNA 上 的 第 34 個 位 置 (anticodon 的第一位置，也稱為 wobble position)，使得 tRNA 對 glutamate、
lysine 與 glutamine 具有專一性[37]。
2. chemotaxis protein methyltransferase (CheR)，參與在細菌接受外界刺激後產
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生的驅化反應。當細菌表面的化學感受器 MCR (methyl-accepting chemotaxis proteins) 接收到外界環境的刺激後，會活化下游訊息傳遞，最終使細菌鞭 毛改變方向，以反應外界的刺激，而 CheR 會藉由甲基化 MCR 上的 glutamates，
形成 L-glutamate 5-methyl ester 後，藉此持續活化下游的訊息傳遞[38]。
由初步資料顯示 (圖 11) NTUH-CIP3 在經過環丙沙星刺激後，參與糖解作用