蛹蟲草目前已被證實具有許多保健功效，此外也已有研究指出 DOW 可有 效促進蟲草素與腺苷等保健成分含量增加。尚未有研究探討 DOW 如何透過調 控蛹蟲草內蛋白質表現，進而影響蛹蟲草菌體生長及功效成分生成，因此本研究 使用蛋白質二維電泳分析蛹蟲草內蛋白質表現，探討 DOW 造成蛹蟲草蛋白質 表現量差異與菌體生長及功效成分生成之相關性。表 4-1、4-2、4-3 及 4-4 結 果顯示 DOW 可透過調控表中之蛋白質，影響蛹蟲草內葡萄糖與能量代謝、蛋 白質摺疊與生合成以及核苷酸代謝，進而造成蛹蟲草菌體乾重及功效成分含量之 差異。DOW 影響之蛋白質名稱及功能簡介如表 5-1、5-2 所示。
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表 5-1 受 DOW 影響之蛹蟲草菌體蛋白質及其功能
Table 5-1 The function of the Cordyceps militaris protein effected by DOW.
名稱 功能 參考文獻
葡萄糖與能量代謝
1. Vacuolar ATP synthase 參與 ATP 能量代謝 Baker et al., 2015 2. Pyruvate dehydrogenase
complex-dihydrolipoamid e acetyltransferase component
催化 pyruvate 氧化生成
acetyl-CoA Mulchand et al., 2014 3. Pyridoxine biosynthesis
protein
調控 pyridoxal 5'-
phosphate 生成 (Svetlana et al., 2015 4. Transaldolase 參與 pentose phosphate
pathway Linck et al., 2014 調控蛋白質生合成
1. Vacuolar protease A
precursor 分解蛋白質 Van et al., 1996
2. Disulfide isomerase 調控蛋白質結構摺疊 Laboissiere et al., 1995 3. Dihydroxy-acid
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表 5-2 受 DOW 影響之蛹蟲草菌體蛋白質及其功能 (接上表)
Table 5-2 The function of the Cordyceps militaris protein effected by DOW.
名稱 功能 參考文獻
調控核苷酸代謝
1. Thioredoxin reductase 還原 thioredoxin Herve, 2011 2. Phosphoribosylglycinami
Barbara and Hiroshi, 2002 具有其他功能之蛋白質 4. Lactam utilization protein
lamB 參與碳水化合物代謝 de Arruda et al., 2013 5. Stomatin family protein 調節離子通道 Lapatsina et al., 2012 6. Sphingolipid long chain
base sensory protein-putative
穩定細胞膜 Peng et al., 2015
7. Dibenzothiophene
desulfurization enzyme A
參與 dibenzothiophene 氧 化
Ohshiro et al., 2002；García et al., 2014
8. Glutathione S-transferase 促進自由基與 GSH 結合 Sheehan et al., 2001 功能未知之蛋白質
1. Hypothetical protein
CCM_07362 未知
94 2015) 。 pyruvate dehydrogenase complex-dihydrolipoamide acetyltransferase component 為 pyruvate dehydrogenase complex 其 中 一 部 分 ， Pyruvate dehydrogenase complex 可催化 pyruvate 氧化生成 acetyl-CoA，而 acetyl-CoA 主要參與糖解作用中 TCA 循環，對於細胞分解葡萄糖生成 ATP 具有極大之影 響力，因此可知 pyruvate dehydrogenase complex 可間接影響 ATP 生合成 (Mulchand et al., 2014)。Pyridoxine biosynthesis protein 目前已知可調控 pyridoxal 5'- phosphate 生成 (Svetlana et al., 2015)，pyridoxal 5'- phosphate 為 glycogen phosphorylase 反應時所需之重要輔酶。在微生物內 glycogen phosphorylase 分 解 glycogen 以產生能量的過程中扮演極為重要之角色 (Livanova et al., 2002)，
因此可知 pyridoxine biosynthesis protein 可透過調控 pyridoxal 5'- phosphate 生 成，間接影響 glycogen phosphorylase 分解 glycogen 產生能量。Transaldolase 參 與 pentose phosphate pathway，可透過 pentose phosphate pathway 將 pentose 轉 化成 fructose-6-phosphate，之後 fructose-6-phosphate 進入糖解代謝路徑中被代 謝生成能量 (Linck et al., 2014)，而 transaldolase 僅在 DOW-CM 中被檢測出。
DOW-CM 中 Vacuolar ATP synthase 、 pyruvate dehydrogenase complex, dihydrolipoamide acetyltransferase component 及 pyridoxine biosynthesis protein 蛋白質表現量相較於 UPW-CM 均為提高。本研究推測 DOW 透過提高蛹蟲草 內 acetyl-CoA 生成，間接提高 TCA 循環生成 ATP 之效率，以及提高 pentose 被代謝生成 fructose-6-phosphate，造成更多 fructose-6-phosphate 生成並進入糖 解代謝中產生 ATP。此外由於 DOW 促使 ATP 代謝速率及營養物質的運輸與儲 存效率提高，且 DOW 引起蛹蟲草內 pyridoxal 5'- phosphate 被大量生成，進而 增加 glycogen phosphorylase 分解 glycogen 之能力，提供蛹蟲草菌絲體生長或是 將腺苷轉化為蟲草素所需之能量。研究指出生物體內 ATP 透過酵素代謝後轉化 為 AMP，再經由脫磷酸化作用生成腺苷 (Jackson 2011)，而腺苷可再經由二次 代謝生成蟲草素 (Zheng et al.,2011)，因此綜合上述可推測 DOW 刺激蛹蟲草內 ATP 生合成，使得 ATP 被大量生成，而這些 ATP 不僅可用於提供蛹蟲草菌體
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生長所需，更可透過酵素轉化生成腺苷，必且近一步經由二次代謝轉化為蟲草 素。
(二) DOW 調控蛋白質生合成相關蛋白質對蛹蟲草生長及代謝產物可能造成之 影響
Vacuolar protease A precursor 為 vacuolar proteases 的前驅蛋白質，經過 proteinase A 或 proteinase B 進 行 蛋 白 質 修 飾 後 生 成 具 有 活 性 之 vacuolar proteases，而 vacuolar proteases 功能為分解蛋白質，對於蛋白質代謝具有一定 的影響力 (Van et al., 1996)。Disulfide isomerase 可調控蛋白質結構摺疊，透過影 響蛋白質內雙硫鍵的鍵結形成，使直鏈蛋白質彎曲摺疊或是改變蛋白質摺疊方向，
進而影響蛋白質結構 (Laboissiere et al., 1995)。Dihydroxy-acid dehydratase 可催 化硫鐵鍵結形成，硫鐵鍵結在催化反應、蛋白質結構穩定及調控代謝路徑等生理 作 用 中 具 有 極 為 重 要 之 地 位 (Flint et al., 1996) 。 因 此 可 知 dihydroxy-acid dehydratase 可透過調控硫鐵鍵結形成，間接影響生物內催化反應、代謝路徑調 控與蛋白質結構穩定等生理作用。Heat shock 70 kDa protein 目前已知參與蛋白 質摺疊、合成與組裝等過程，heat shock 70 kDa protein 被 ATP 活化後，其結構 內 18-kDa peptide-binding domain 及 C-terminal 10-kDa lid domain 便將蛋白質 夾住進行折疊 (Mehdi and Céline., 2008)。Sarcosine oxidase 可藉由氧化 sarcosine 生成蛋白質組成所需之基本胺基酸 glycine (Goyer et al., 2004)。T-complex protein 1 為含有八個亞基的蛋白質複合體，具有摺疊蛋白質之功能，而 t-complex protein 1 subunitγ則為其八個亞基其中之一 (Kelly et al., 2013)。
由表 4-1、4-2、4-3 及 4-4 之結果顯示，推測 DOW 增加蛹蟲草內蛋白質 代謝速率，並提高蛋白質組成所需之基本氨基酸生成，且對蛋白質間雙硫鍵形成 及蛋白質摺疊進行調控，並降低非必要之硫鐵鍵結與蛋白質摺疊，減少非必要之 蛋白質形成，因此 DOW 透過影響蛹蟲草菌體內與蛋白質生合成相關之蛋白質 表現量，以提供合成菌體生長及代謝產物生成相關酵素所需之蛋白質，間接促使 蟲草菌體生長及代謝產物增加。
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(三) DOW 調控核苷酸代謝相關蛋白質對蛹蟲草生長及代謝產物可能造成之影 響
Thioredoxin reductase 可 透 過 消 耗 NADPH 還 原 thioredoxin ， 而 thioredoxin 可 恢 復 ribonucleotide reductase 酵 素 活 性 ， 使 ribonucleotide reductase 能生成 deoxyribonucleoside diphosphates 並經由 DNA polymerase 轉 化成 deoxyribonucleoside triphosphates，因此 thioredoxin reductase 可間接影響核 苷酸生成 (Herve., 2011)，Thioredoxin reductase 僅於 DOW-CM 中被檢測出。
Phosphoribosylglycinamide formyltransferase 目前已知參與 purine 生合成，在反 應過程中負責將 glycinamide ribotide 轉化成 formyglycinamide ribotide 以便後 續反應進行，對於核苷酸生成具有一定的影響力 (Armenta et al., 2014)，
Phosphoribosylglycinamide formyltransferase 也僅於 DOW-CM 中 被 檢 測 出 。 Allantoicase 在 adenosine monophosphate 代謝路徑中負責將 allantoate 分解成 urea 與 ureidoglycolate (Barbara and Hiroshi., 2002)。
根據實驗結果推測 DOW 透過提高 allantoicase 表現量，增加 AMP 代謝速 率，且增加 thioredoxin reductase 在蛹蟲草中含量，間接促使 dNTP 生成量提高，
以及增加 phosphoribosylglycinamide formyltransferase 表現量提高 purine 含量，
藉 由 對 allantoicase 、 thioredoxin reductase 及 phosphoribosylglycinamide formyltransferase 進行調控，以影響蛹蟲草內核苷酸代謝，提供蛹蟲草充足的核 其中之一，在真菌內功能為連接 β-1,3-glucan，使 β-1,3-glucan 形成長鏈以做為 真菌之細胞壁 (Zhao et al., 2014)。Phenol 2-monooxygenase 目前已知參與酚類物 質代謝過程，許多微生物可透過 phenol hydroxylase 與 phenol 2-monooxygenase 氧化分解 phenolic compounds 以獲得能量及 phenol (Lobo et al., 2014)，而 phenol 研 究 指 出 具 有 抗 氧 化 之 效 果 (Habermann et al., 2016) 。 Acyl-CoA N-acyltransferase 是催化 acyl group 轉移的重要酵素之一，參與 TCA 循環、脂 肪酸生成及脂肪代謝等過程，對於能量代謝具有一定的影響力 (Fu et al., 2015)。
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Lactam utilization protein lamB 參與碳水化合物代謝 (de et al., 2013)，可藉由影響 碳水化合物的代謝，間接調控能量生成。Stomatin family protein 具有調節離子通 道之功能，但確切之調控機制尚未釐清 (Lapatsina et al., 2012)。Sphingolipid long chain base sensory protein-putative 目前僅知可能具有穩定細胞膜之功能 (Peng et al., 2015)，但確切之功能仍尚未釐清。Dibenzothiophene desulfurization enzyme A 參與 dibenzothiophene 氧化之過程，可透過催化 dibenzothiophene 氧化生成具 有殺菌功能之 2-Hydroxybiphenyl (2-HBP) (Ohshiro et al., 2002；García et al., 2014)。Hypothetical protein CCM_07362 為蛹蟲草內假設性存在之蛋白質，目前 尚未有關於此蛋白質之相關文獻。Glutathione S-transferase 可促進自由基與 GSH 結合，避免 H2O2 等過氧化物質引起細胞凋亡 (Sheehan et al., 2001)。
由表中結果推測蛹蟲草可能藉由提高 sphingolipid long chain base sensory protein, putative，穩定快速增加之細胞膜，以應對 DOW 促進蛹蟲草菌絲體生長 的情況，且透過增加 acyl-CoA N-acyltransferase 及 lactam utilization protein lamB
，加快 TCA 循環與碳水化合物的代謝，提供 DOW 促進菌體生長與轉換腺苷 為蟲草素時所需之能量，此外蛹蟲草透過提高 phenol 2-monooxygenase 與 glutathione S-transferase，加速分解 phenolic compounds 以獲得 phenol，並且增 加 GSH 與自由基結合的能力，藉由提高蛹蟲草抗氧化能力，避免產生能量時所 產 生 之 過 氧 化 物 及 自 由 基 對 細 胞 造 成 氧 化 損 傷 ， 而 dibenzothiophene desulfurization enzyme A 表現量增加，則可能是為了與其他物種競爭生長環境所 產生之競爭手段，至於 stomatin family protein 含量減少則可能是蛹蟲草為了穩 定體內滲透壓所造成之結果，另外 1,3-β-glucanosyltransferase Gel1 表現量下降，
推 測 蛹 蟲 草 已 過 菌 絲 快 速 生 長 的 時 期 ， 因 此 不 需 要 大 量 1,3-β-glucanosyltransferase Gel1 以調控細胞壁生成。
(五) DOW 富含的離子對蛹蟲草菌體內蛋白質之影響
1998 年 Kianga 與 Tsokosa 的研究指出透過增加細胞內鈣與鈉離子濃度，可對 heat shock 70 kDa protein 的蛋白質表現量進行調控 (Kiang and Tsokos 1998)，因 此推測深層海水所富含之鈣與納離子進入蛹蟲草的細胞內，促使蛹蟲草菌體內 heat shock 70 kDa protein 表現量增加。Paulo 與 Hernâni 研究指出鈉離子可促使 植物內 Vacuolar ATP synthase 蛋白質表現量增加，以維持植物細胞內鈉離子濃 度的平衡，增加植物的耐鹽性 (Silva and Geros 2009)，故蛹蟲草可能是由於受到
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深層海水中鈉離子的刺激，促使菌體內 Vacuolar ATP synthase 蛋白表現量增加。
此外已有研究指出鈣離子濃度變化可調控 pyruvate dehydrogenase phosphatase ， 並對 pyruvate dehydrogenase complex 的酵素活性造成影響 (Denton 2009)，而本 實 驗 中 結 果 顯 示 以 深 層 海 水 培 養 蛹 蟲 草 ， 可 增 加 蛹 蟲 草 內 pyruvate dehydrogenase complex 蛋白質表現量，因此推測深層海水中所含之鈣離子不僅 可 影 響 pyruvate dehydrogenase complex 的 酵 素 活 性 ， 更 可 能 對 pyruvate dehydrogenase complex 蛋白質表現量造成影響。2016 年 Zhao 等人的研究中顯 示，transaldolase 在高濃度的鈉離子環境中表現量會增加，為細胞提供更多能量 (Zhao et al. 2016)，而深層海水富含鈉離子 可能因此刺激蛹蟲草內 transaldolase 蛋白質表現量增加。藉由上述研究結果可推測深層海水所含豐富之鈣與鈉離子，
刺激 heat shock 70 kDa protein、Vacuolar ATP synthase、pyruvate dehydrogenase complex 及 transaldolase 等，與蛹蟲草蛋白質生合成及能量與葡萄糖代謝相關之 蛋白質表現量增加，促使蛹蟲草菌體生長速率與菌體量增加，並間接使得蛹蟲草 內蟲草素與腺苷含量增加。
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圖 5-1 DOW 對蛹蟲草菌體內蛋白質之調控作用
Fig 5-1 The regulatetion of DOW on the protein of Cordyceps militaris mycelium
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