於不同中性球濃度免疫微珠捕捉實驗

圖 4-3 不同細胞濃度免疫微珠捕捉結果預測圖

圖 4-4 不同細胞濃度免疫微珠捕捉實際實驗結果 (A)免疫微珠捕捉細胞數目分佈圖 (B)免疫微珠捕捉細胞顯微影像

微流道製作結果與量測

以微奈米製程將矽晶圓模板製作完成，再經由軟微影製程製作出微流道晶片，

如圖 4-5，接著以倒立式螢光顯微鏡拍攝流道細部結構，結果如圖 4-6，第一區

(ZoneA)設計為捕捉聚集在一起的免疫微珠，第二區(ZoneB)則是捕捉單顆的免疫微 珠，第三區(ZoneC)則是捕捉細胞的區域，流道厚度經由膜厚儀量測為 39μm，誤差 約為正負 2μm，另外實際以 CellSens 軟體量測陷阱流道寬度，即圖 4-6 之白圈處，

量測結果如圖 4-7，第一區第一排(ZoneA_1)設計為 60μm，實際量測為 58.27μm；

第一區第二排(ZoneA_2)設計為 45μm，實際量測為 43.76μm；第一區第三排 (ZoneA_3)設計為 30μm，實際量測為 30.64μm；第二區設計為 20μm，實際量測為 19.03μm；第三區設計為 9μm，實際量測結果為 9.89μm。就結果而言，流道製作的 結果與設計非常接近，誤差小於 10%，且陣列之間非常均勻，異質性不大因此預期 能夠依造設計的方式，分別捕捉大小不同的粒子。

圖 4-5 微流道製作結果

圖 4-6 流體動力學式微流道顯微影像

圖 4-7 陷阱流道寬度量測

螢光珠及免疫微珠微流道捕捉及分離實驗

本實驗目的是以微流道分離並捕捉不同大小的粒子，以驗證微流道晶片實際 捕捉粒子的能力，並最佳化各項流體參數。本實驗以螢光珠模擬白血球細胞，與免 疫微珠樣本成為混合樣本，螢光珠濃度為 80 顆/μL、免疫微珠濃度為 15 顆/μL，在 實驗中以顯微鏡觀測，發現混合樣本中的免疫微珠，在流速 1μL/min 的流速下，由 實驗影片中得知，免疫微珠皆被捕獲於流道的第一區及第二區，沒有流入第三區或 是流出流道出口，捕獲率為 100%，且由實驗影像得知，所有的陷阱皆捕獲單一的 免疫微珠，而所有的螢光珠也都被捕捉於微流道中，沒有流失，並且有 93.5%在第 三區被捕捉。在整個晶片中，由於流道高度是 39μm，而螢光珠只有 14.8μm，因此 在第三區的陷阱中，會有兩顆螢光珠上下交疊堵住陷阱流道的情形，造成第三區陷 阱中單顆螢光珠捕捉率低，但仍然可利用影像處理軟體 ImageJ 分析螢光強度的方 式，計算出有多少顆螢光珠同時被一個陷阱所捕捉，如圖 4-8，實際操作方法為調 整影像中亮度的門檻值，將單顆螢光珠亮度的最高值設為門檻，高於此門檻的亮點 會以紅色顯示，將此紅點定義為兩顆螢光珠，再統計整體數量，計算後發現在已被 佔據的陷阱中有 85.3%的陷阱都具有兩顆的螢光珠，實驗顯微影像如圖 4-9，實驗 統計結果如圖 4-10，在此實驗中證實本論文所設計之微流道確實具有分離及捕捉 大小不同粒子的能力。

圖 4-8 以 ImageJ 軟體分析螢光珠捕捉數 (A)原始圖片 (B)調整灰階 threshold 值後之圖片

圖 4-9 微流道晶片分離及補捉單顆免疫微珠及螢光珠實驗顯微影像

圖 4-10 微流道晶片分離及捕捉單顆免疫微珠及螢光珠實驗結果

疫微珠濃度提高的原因是免疫微珠具較高的密度，在入口端會發生沉降而使濃度 相對提高。實驗結束後，經由顯微影像的記錄，發現共捕捉到 154 顆免疫微珠及 384 顆細胞，因此免疫微珠及細胞補獲率分別為 100%及 96%，另外發現 THP-1 細 胞具有表面蛋白 CD15 的表現性，有大約 54.25%的細胞與 Anti-CD15 免疫微珠鍵 結，實驗結果如圖 4-14，各區的捕捉情形如圖 4-15，最後分析了微流道整體的捕 捉及分離效率，結果如圖 4-16，免疫微珠的捕捉分布情形與節 4.3 相近，而單一 免疫微珠捕捉率則為 70.45%，造成比率下降的原因為樣本中複數顆免疫微珠同時 抓取同一顆 THP-1 細胞，因此在流道中會聚在一起流動，而被捕捉在同一個陷阱 中；而 THP-1 捕捉分布情形與節 4.3 中螢光珠的捕捉分布情形差異很大，原因為 THP-1 表面具有表面蛋白 CD15 的表現性，因此在第一區及第二區的捕捉率大幅 提升。

圖 4-11 THP-1 細胞與免疫微珠於細胞計數盤影像

圖 4-12 於 0.16μL /min 流速下，細胞流失過程，比例尺 50μm

圖 4-13 流體動力學式微流道捕捉免疫微珠及 THP-1 細胞顯微影像，

比例尺 100μm

圖 4-14 免疫微珠與 THP-1 細胞捕捉效率圖

圖 4-15 微流道晶片分離及捕捉免疫微珠及 THP-1 細胞實驗顯微影像 (A、B)第一區 (C、D)第二區 (E、F)第三區

圖 4-16 微流道晶片分離及捕捉免疫微珠及 THP-1 細胞實驗結果 (A) 免疫微珠與 THP-1 細胞於不同區域捕捉效率圖

(B) 單一陷阱捕捉粒子數目分布圖

真實腹膜透析液白血球捕捉及分離

圖 4-17 以流式細胞儀檢測之樣本資訊

圖 4-18 使用細胞計數盤計算白血球被免疫微珠捕捉率之顯微影像

圖 4-19 免疫微珠及白血球捕獲影像

圖 4-20 免疫微珠與白血球捕捉效率圖

表 4-1 腹膜透析樣本實驗記錄及比較表

圖 4-22 中性球初始濃度對免疫微珠抓取結果之影響

圖 4-23 流式細胞儀偵測與免疫微珠抓取中性球比例關係圖

Chapter 5 結論與未來展望

本論文中假設免疫微珠捕捉到的細胞都是中性球，然而並未以實驗驗證過，因

圖 5-1 以微幫浦、微混合器、微反應槽完成樣本混合前處理步驟實例[36]

參考文獻

[1] Bashir, R. BioMEMS: state-of-the-art in detection, opportunities and prospects.

Advanced drug delivery reviews 56, 1565-1586, (2004).

[2] Grayson, A. C. R., Shawgo, R. S. & Johnson, A. M. A BioMEMS review:

MEMS technology for physiologically integrated devices. Proceedings of the IEEE 92, 6-21, (2004).

[3] Chin, C. D., Linder, V. & Sia, S. K. Lab-on-a-chip devices for global health: Past studies and future opportunities. Lab on a Chip 7, 41-57, (2007).

[4] Mark, D., Haeberle, S., Roth, G., von Stetten, F. & Zengerle, R. Microfluidic lab-on-a-chip platforms: requirements, characteristics and applications.

Chemical Society reviews 39, 1153-1182, (2010).

[5] Culbertson, C. T. & Mickleburgh, T. G. Micro total analysis systems:

Fundamental advances and biological applications. Analytical chemistry 86, 95-118, (2013).

[6] Kovarik, M. L., Ornoff, D. M., Melvin, A. T. & Dobes, N. C. Micro total analysis systems: fundamental advances and applications in the laboratory, clinic, and field. Analytical chemistry 85, 451-472, (2012).

[7] Vilkner, T., Janasek, D. & Manz, A. Micro total analysis systems. Recent developments. Analytical chemistry 76, 3373-3386, (2004).

[8] Chow, K. et al. Predictive value of dialysate cell counts in peritonitis

complicating peritoneal dialysis. Clinical Journal of the American Society of Nephrology 1, 768-773, (2006).

[9] Johnson, D. W., Wiggins, K. J. & Armstrong, K. A. Elevated white cell count at commencement of peritoneal dialysis predicts overall and cardiac mortality.

Kidney international, (2005).

[10] Kofteridis, D. P., Valachis, A., Perakis, K. & Maraki, S. Peritoneal dialysis-associated peritonitis: clinical features and predictors of outcome. International Journal of Infectious Diseases 14, e489-e493, (2010).

[11] Lin, C. Y., Roberts, G. W. & Kift-Morgan, A. Pathogen-specific local immune fingerprints diagnose bacterial infection in peritoneal dialysis patients. Journal of the American Society of Nephrology 24, 2002-2009, (2013).

[12] Daugirdas, J. T., Blake, P. G. & Ing, T. S. Handbook of dialysis. (Lippincott Williams & Wilkins, 2012).

[13] Iv, S. C. W., Reyes, C. D. & López, G. P. Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation. Lab on a Chip 15, 1230-1249, (2015).

[14] Sajeesh, P. & Sen, A. K. Particle separation and sorting in microfluidic devices:

a review. Microfluidics and nanofluidics 17, 1-52, (2014).

[15] Rusconi, R., Garren, M. & Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual review of biophysics 43, 65, (2014).

[16] Ahmed, D., Mao, X., Juluri, B. K. & Huang, T. J. A fast microfluidic mixer based on acoustically driven sidewall-trapped microbubbles. Microfluidics and Nanofluidics 7, 727-731, (2009).

[17] Mao, X., Juluri, B. K., Lapsley, M. I., Stratton, Z. S. & Huang, T. J. Milliseconds microfluidic chaotic bubble mixer. Microfluidics and Nanofluidics 8, 139-144,

[19] Landenberger, B., Höfemann, H., Wadle, S. & Rohrbach, A. Microfluidic sorting of arbitrary cells with dynamic optical tweezers. Lab on a Chip 12, 3177-3183, (2012).

[20] Werner, M., Merenda, F., Piguet, J., Salathe, R.-P. & Vogel, H. Microfluidic array cytometer based on refractive optical tweezers for parallel trapping, imaging and sorting of individual cells. Lab on a Chip 11, 2432-2439, (2011).

[21] Wang, M. M. et al. Microfluidic sorting of mammalian cells by optical force switching. Nature biotechnology 23, 83-87, (2005).

[22] Jonáš, A. & Zemanek, P. Light at work: The use of optical forces for particle manipulation, sorting, and analysis. Electrophoresis 29, 4813-4851, (2008).

[23] Cheng, I.-F., Chang, H.-C., Hou, D. & Chang, H.-C. An integrated

dielectrophoretic chip for continuous bioparticle filtering, focusing, sorting, trapping, and detecting. Biomicrofluidics 1, 021503, (2007).

[24] Hu, X. et al. Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 15757-15761, (2005).

[25] Xia, N. et al. Combined microfluidic-micromagnetic separation of living cells in continuous flow. Biomedical Microdevices 8, 299-308, (2006).

[26] Pamme, N. & Wilhelm, C. Continuous sorting of magnetic cells via on-chip free-flow magnetophoresis. Lab on a Chip 6, 974-980, (2006).

[27] Evander, M. et al. Noninvasive acoustic cell trapping in a microfluidic perfusion system for online bioassays. Analytical chemistry 79, 2984-2991, (2007).

[28] Rettig, J. R. & Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Analytical chemistry 77, 5628-5634, (2005).

[29] Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H. & Sturm, J. C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science 304, 987-990, (2004).

[30] Carlo, D., Wu, L. Y. & Lee, L. P. Dynamic single cell culture array. Lab on a Chip 6, 1445-1449, (2006).

[31] Zheng, S. et al. Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells. Journal of

chromatography A 1162, 154-161, (2007).

[32] Tan, W.-H. H. & Takeuchi, S. A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 1146-1151, (2007).

[33] Kim, J., Erath, J., Rodriguez, A. & Yang, C. A high-efficiency microfluidic device for size-selective trapping and sorting. Lab on a Chip 14, 2480-2490, (2014).

[34] Yung, C. W., Fiering, J., Mueller, A. J. & Ingber, D. E. Micromagnetic–

microfluidic blood cleansing device. Lab on a Chip 9, 1171-1177, (2009).

[35] Kuijpers, T. et al. Membrane surface antigen expression on neutrophils: a reappraisal of the use of surface markers for neutrophil activation. Blood 78, 1105-1111, (1991).

[36] Wu, H.-W., Hsu, R.-C., Lin, C.-C., Hwang, S.-M. & Lee, G.-B. An integrated microfluidic system for isolation, counting, and sorting of hematopoietic stem cells. Biomicrofluidics 4, 024112, (2010).