第一節 實驗材料 一、細胞株來源：
本實驗所使用之細胞株 A549、CH27、H460 為人類肺癌細胞株 (human lung cancer cell lines)，由美國組織細胞庫 (ATCC)購得。A549 為肺腺癌細胞株 (lung adenocarcinoma cell line)；CH27 為肺鳞狀細胞 癌細胞株 (squamous lung cancer cell line)；而 H460 則為大細胞肺癌 細胞株 (small cell lung cancer cell line)。
二、 實驗試劑：
1. Rh2:
由台灣生福生技公司提供，粉劑溶於DMSO 及 100% alcohol 中，
比例為1:5。
2. 台灣榮民製藥：
Penicillin, Streptomycin
3. ABI (American Biorganics INC):
Tris
4. Amersham:
ECL detection kits
5. BD PharMingen:
Anti-cyclin A monoclonal antibody，Anti-cyclin E monoclonal antibody
6. BD Transduction Laboratory:
Anti-Cdkl monoclonal antibody, Anti-Cdk2 monoclonal antibody, Anti-Cdk4 monoclonal antibody, Anti-cyclin B monoclonal antibody, Anti-cyclin D1 monoclonal antibody, Anti-cyclin D3 monoclonal antibody, Anti-pRbl monoclonal antibody, Anti-pRb2/p130
monoclonal antibody 7. Bio-Rad：
Acrylamide, Ammonium Persulfate (APS), Glycine, Kaleidoscope
Prestained Standards, N,N'-methylene-bis-acrylamide (Bis), N,N,N',N',-Tetra-methylethylenediamine (TEMED)
11. NEN:
L-glutamine , Non Essential Amino Acid Solution (NEAA), Polyvinylidene fluoride (PVDF) Transfer Membrane, Trypsin
12. Merck:
2-Mercaptoethanol (2-ME ), EDTA (C10H14N2Na2O8．2H2O), Dimethylsulfoxice (DMSO), Methanol, Sodium dodecyl sulfate
(SDS), Sodium chloride (NaCl), Xylene cyanol 13. Pharmacia:
Protein A sepharose
14. Santa Cruz Biotechnology, Inc:
Anti-CDK6 polyclonal antibody, Anti-cyclin D2 monoclonal antibody,
Anti-pl5 polyclonal antibody, Anti-pl6 polyclonal antibody, Anti-p27 polyclonal Antibody
15. Sigma:
Berrberine hemisulfate, Dithiothreitol (DTT), Leupeptin,
Methylene blue (C16H18CIN3S．3H2O), Propidium Iodide (PI), Sodium Pyruvate
16. Upstate Biotechnology
Anti-Akt phospho-specific monoclonal antibody, Anti-p21 monoclonal antibody, Anti-p53 monoclonal antibody 17. Bio Vision
Caspase activity assay kits
第二節 實驗方法與步驟 一、細胞培養:
1.細胞培養液的配製
將 RPMI 1640 粉末先溶於約 9.5 L Mili-Q 去離子水中，加入 20 g 的NaHCO3，再用HCl 調整 pH 至 7.0~7.2 後以 Mili-Q 去離子水補足 體積至10 L，然後以 0.22 µM 的過濾器過濾滅菌，最後儲存於 4℃
冰箱備用。
2.完全培養液
每 500 ml RPMI 1640 細胞培養液添加 100 IU 青黴素 (Penicillin)、100 µg 鏈黴素 (Streptomycin)、2 mM 麩胺酸
(L-glutamine)、100 µM 非必須胺基酸 (non-essential amino acid)，
1mM 焦葡萄酸鈉 (sodium pyruvate)，最後加入 10% 胎牛血清 (fetal bovine serum，FBS)即得。
3.細胞株的培養
H460、A549 和 CH27 三種肺癌細胞株，均以 RPMI 1640 完全 培養液培養於37℃、5% CO2的培養箱中;繼代培養 (subculture)時，
先用PBS (Phosphate-Buffered Saline)清洗 1 至 2 次，再以 TEG (0.05 mM trypsin、2.5 mM EDTA 和 2.8 mM glucose)處理數 mins，使細胞 與培養皿底解離，最後分種於新的細胞培養皿中，每一培養皿注入 約7 ml 的細胞培養液，細胞培養液每兩天更換一次。
二、細胞數目的測定:
將培養於細胞培養皿的細胞經 TEG 處理過後，以 3~5 ml 的培 養液將細胞打下來，使用血球計數器 (hemocytometer)計算所有的 細胞數目，接著以每ml 有 1x105個細胞分種於12 孔細胞培養盤中，
每孔加入1 ml 細胞與培養液的混和液，均勻搖散細胞後，將細胞 培養於37℃，5％ CO2的培養箱中，經24 hrs 後給予各濃度藥物 (3 µg/ml，10 µg/ml，30 µg/ml)處理，再經 8、16、24、48、72 hrs 後，
以血球計數器計算各孔盤內的細胞數，每一藥物濃度處理為三重 覆。
三、流式細胞分析儀測定:（74）
將細胞以每 10 ml 有 1x106個細胞種於10 cm 的培養皿中，在 藥物汁別處理16、24、48 hrs 後，先以 PBS 清洗細胞，再將細胞
用TEG 處理，用 1 ml PBS 細胞打下來，置於 1.5 ml 的 eppendorf tube 中，置於37℃中作用 30 mins，最後置於冰上，利用 flowcytometer (FACScan)儀器分析，所得之結果以 ModFIT LT 2.0 軟體分析，加以 量化之。
四、蛋白質定性與定量的分析：
1. 蛋白質的萃取 (Protein Extraction)
將細胞用冰的 PBS 洗二次後用刮棒刮下，於 4℃下 5000 rpm 離心5 mins，倒掉上清液並用棉棒將多餘的水吸乾，加入適量的 RIPA buffer [50 mM Tris (pH 7.4)，150 mM NaCl，1% NP-40，0.25%
Na Deoxycholate，5 mM EDTA (pH 8.0)，l mM EGTA (pH 8.0)，*l mM DTT，*5 µg/ml Leupeptin，*0.2 mM PMSF，*5 µg/ml
Aprotinin，*1 mM Na Vanadate，*l mM NaF (*add before use)]，將 細胞pellet 均勻打散置於冰上作用 20 mins，接著以超高速離心 55000 rpm、4℃、30 mins，收集上清液，以 Bradford 的方法測量
蛋白質溶液，在波長595 nm 下的吸光值，換算成蛋白質濃度 (g/l) [以一系列已知濃度的 BSA 做成之 standard curve 換算蛋白質濃 度。以每個 eppendorf tube 50 g 的蛋白質分裝並用 RIPA buffer 調整 成相同體積，接著再加入調整完體積的蛋白質溶液 1/3 量的 4 X protein loading dye (8% SDS，0.04% Serva blue R-250，40%
glycerol，200 mM Tris pH 6.8，10% 2-mercaptoethanol )，以 95℃
乾浴加熱變性 10 mins 後，即可置於-80℃中保存。
2. 聚丙烯醯胺膠體電泳法 (SDS-PAGE Assay)
將蛋白質依分子量分離利用SDS-PAGE，首先配製 1.5 mm 厚 的discontinuous acrylamide gel，gel 分上下兩層，下層 separating gel 其 acrylamide 的百分比視分析蛋白質分子量而定，上層的 stacking gel 則含 4% acrylamide。配製完成的膠體放置於電泳槽內，加入 電泳緩衝液 (running buffer: 25 mM Tris，192 mM glycine，0.1%
SDS)。接著將萃取出的蛋白質與 4 X protein loading dye 混合液再 以 95℃乾浴加熱變性 10 mins，冰浴冷卻後離心。將各 sample 及 標示標準分子量的 Multimaker 依序注入膠體的孔槽中，通以電壓 80 Volts，待樣品通過 stacking gel 後電壓調整為 100 Volts，當 serva blue R-250 的 dye 跑到膠片底部或視其需要，即可將電源關閉。
3.西方轉漬法 (western blot)（50）
將PVDF membrane 浸於 methanol 數秒後以 Mill-Q 水浸濕，接 著裁好的濾紙與 membrane 先浸泡在 transfer buffer (50 mM tris，
40 mM glycine，0.375% SDS，pH 9.0－9.4; 20% methanol)中。栽 下電泳膠中所要轉漬的區域後，亦浸泡於 transfer buffer 中。轉印 石墨板之正極板以 transfer buffer 潤濕後，依序重疊平鋪 4 張濾 紙、membrane、gel、4 張濾紙，最後蓋上以 transfer buffer 潤濕的 負極石磨板，設定電流 (電流=濾紙面積 X 9/7 X 疊數)，通電流經 1 hr 又 10 mins 後將 membrane 取出，浸泡於 5% non-fat milk/TBST 中，於室溫下搖晃至少 30 mins。以 TBST buffer (24.22 g Tris，87.75 g NaCl，10 ml Tween 20，加水調到 1 L)清洗 membrane 10 mins 三
離心5 mins，倒掉上清液並用棉棒將多餘的水吸乾，加入適量的 1ysis buffer (RIPA butter：Tris buffer=1：1，*200 µM PMSF，*20 µl/ml Leupeptin，*1 mM NaF，*1 mM Sodium Vanadate) (*add before used)，依照上述萃取蛋白質的步驟，取定量蛋白質 Leupeptin，20 µM PMSF，1 mM Sodium Vanadate，1 mM NaF) 清洗1 次，每次清洗於 4℃下以 7000 rpm 離心 5 mins，完成後吸
照西方轉漬法的步驟，將蛋白質轉印到PVDF membrane 後，將 membrane 裝於透明塑膠袋內並置於片夾中，在暗房中以
X-rayfllm 直接感光顯影，再以自動沖片機沖片。
六、細胞內分子之螢光染色 (Intracelluar fluorescence staining) 1.懸浮或漂起的細胞：
收集細胞培養液以 3600 rpm 離心 5 mins，沉降之細胞以含有 2 mM EDTA 的 PBS (Phosphate buffer saline)溶液清洗後再離心，然 後細胞以75% ethanol 置於-20℃固定 l hr，再以 PBS 清洗離心，
倒掉上清液，加入0.1% Triton X-100 in PBS 在室溫下處理 30 mins 後重複清洗離心的步驟。加入1 µg/ml DAPI 置黑暗中染色 l hr，
最後經2 次以上的清洗去除多餘的染劑後加入少許 PBS 使細胞 懸浮其中，將懸浮液倒在培養盤中於螢光顯微鏡下觀察、拍照。
2.貼附在培養皿的細胞：
附著在培養盤之細胞以 PBS 清洗後，用 75% ethanol 在-20℃下 固定1 hr，再以 0.1% Triton X-100 in PBS 處理 30 mins 使細胞膜 產生孔隙得以讓染劑進入。30 mins 後以 PBS 清洗後加入 DAPI 染劑在黑暗中染色1 hr，以 PBS 清洗多餘染劑之後置螢光顯微鏡 下觀察、照相。
七、DNA 的萃取和電泳分析
收集細胞以 3600 rpm 室溫下離心 10 mins，沈降下來的細胞以 PBS 清洗後再離心。倒掉上清液加入 800 µl 細胞溶解液
(extraction buffer：Tris 50 mM，EDTA 10 mM，Triton X-100 0.3%) 置冰上作用 20-30 mins，加入 20 µl RNase 於 55℃水浴作用 30 mins 後再加入 20 µl proteinase K 置 55℃水浴 10 mins，快速離心 後取上清液以等體積的phenol 萃取 1 次，chloroform 萃取 2 次，
依次將細胞溶出液與有機溶劑充分混合均勻，離心 5 mins 後，
收集水層並加入 10% 體積 NaOAc，再加入 2.5 倍體積冰冶的 100% ethanol 置-20℃沈降一夜。沈降完畢後以 12,000 rpm 離心 20 mins，倒掉上清液，以棉籤將管壁拭乾，加入 TE buffer (10 mM buffer【0.5 X TBE buffer containing: Tris 5.4 g, boric acid 2.75 g，2 m1 0.5 M EDTA (pH 8.0)】為電冰緩衝液，電壓 25 Volts 跑 16-18 hrs。
八、凋亡細胞之偵測-TUNEL 分析
染色體斷裂為細胞凋亡的普遍現象，造成許多 DNA 端 3'OH 的 暴露。DNA 端 3'OH 可被量化，以偵測細胞凋亡，而不需溶解細 胞。
1.細胞用 paraformaldehyde 固定在 PBS 中，接著用乙醇固定。
2.細胞清洗後在 37℃緩衝液與 TdT enzyme (terminal
deoxynucleotidyl transferase)與 Br-dUTP (bromodeoxyuridine triphosphate)反應 60 mins。在這過程中，bromodeoxyuridine 結合 進入3'DNA 端。
3.在 bromodeoxyuridine 處理後，標示的細胞徹底的沖洗後與
bromodeoxyuridin 的抗體 FITC (fluorescein isothiocyanate)培養 30 mins。FITC 標示的 anti-bromodeoxyuridine 抗體指出 3'自由端的 數目。細胞的 RNA 被消化與所有的 DNA 被含 RNase A plus propidium iodide 染色。以 propidium iodide 對細胞染色用來檢測 細胞DNA 的總量。
4.著色的細胞用 flow cytometry 分析
flowcytometer 用 argon laser 發出 488 nm 的光以分析 FITC 與 propidium iodide 信號。FITC 在 520 nm 波長顯示螢光，propidium iodide 在 623 nm 波長顯示螢光，然而，FITC 與 propidium iodide
staining 只能觀察單一樣品。
九、caspase activity assay (caspase 活性分析)
caspase 的活性以原廠的提供步驟進行。簡述之，即細胞溶液 (100 µg 總蛋白)加入反應混合物(最後容量 50 µ1)內含螢光氨基酸 物質為caspase 的分解基質 (即 caspase-l (YVAD-AFC)，caspase-3 (DEVD-AFC)，caspase-8 (IETD-AFC) 與 caspase-9 (LEHD-AFC) 的反應基質 (substrates)。此反應在 37℃中作用 2 hrs。螢光用 fluorescence microplate reader (excitation wavelength，400 nm；
emission wavelength，505 nm)偵測。
十、統計分析 (statical analysis)
所有資料於此報告中以三個獨立的實驗後以 mean±SD 評 估。統計誤差以 Student’s t-test，其 p 值設在*, p<0.05，**, p<0.01，
***, p<0.001。
第四章 結果
第一節 Rh2 對肺腺癌細胞的抑制增殖作用
三種人類肺癌細胞株 A549 (肺腺癌細胞)、CH27 (鱗狀細胞癌)、
H460 (大細胞癌)以每孔 1x105的細胞密度植入12 孔的培養盤中，分 別以0、3 µg/ml、10 µg/ml、30 µg/ml 的 Rh2 處理 72 hrs。每二天重 新更新含有藥劑的培養液，分別於給藥的8、16、24、48、72 hrs 後，
以Trypan blue dye 染色，利用血清計數器計算出確實的細胞數目，而 得一細胞生長的曲線圖 (圖 4-1)。由圖 4-1 得知對三株肺癌細胞株均 有顯著且相近的生長抑制作用，隨著劑量的增加及作用時間的加長，
Rh2 對肺癌細胞的抑制增殖作用愈強，呈現劑量-時間依存效應 (dose-and time-dependent response)。細胞在處理 10 µg/ml、30 µg/ml 的濃度下經過16 hrs 即有明顯的生長抑制現象。30 µg/ml Rh2 經 24 hrs
外細胞的形態 (morphology)也有所不同，細胞變的較皺縮，甚至有細 胞無法貼附在培養皿上而飄浮起來。
由上面的結果得知 Rh2 對肺腺癌細胞有抑制增殖作用，這樣的 作用是否會對正常的細胞也會造成影響，於是本實驗取大鼠的肝臟星 狀細胞 (rat hepatic stellate cells)、內皮細胞 (rat endothelial cells)及人 類肺纖維細胞 (WI-38 human lung fibroblast)當作正常細胞，分別未處 理及處理30 µg/ml Rh2，培養 0-6 days，Trypan blue dye 染色後以血 清計數器計算細胞數目。結果發現Rh2 會抑制肺腺癌細胞株的增殖，
且長時間處理會造成細胞死亡，但對這三株正常細胞的生長會抑制，
但並不會造成正常細胞的死亡 (圖 4-3)。
圖4-1 Rh2 抑制肺腺癌細胞的增殖
三種肺癌細胞 (A549, CH27, H460)分別處理不同濃度的 Rh2 (0, 3, 10, 30 µg/ml)，0, 8, 16, 24, 48 及 72 hrs 後以 Trypan blue dye 染色，用血清計數器直接計數癌細胞的數目。隨著劑量的增 加及作用時間的加長，Rh2 對肺癌細胞的抑制增殖作用愈強，呈 現劑量-時間依存效應 (dose-and time-dependent response)。
圖4-2 Rh2 造成癌細胞形態上的改變
三種肺癌細胞 (A549, CH27, H460)分別未處理及給予 30 µg/ml Rh2，48 hrs 後在顯微鏡下觀察細胞的形態 (morphology)，下排三個 圖為Rh2 處理組，細胞的數目減少且細胞的外形也有改變--細胞較皺 縮。此圖為顯微鏡放大倍率100 倍；scale bar，20 µm。
圖4-3 正常細胞對 Rh2 較具抗性
取大鼠的肝臟星狀細胞 (rat hepatic stellate cells)、內皮細胞 (rat endothelial cells)及人類肺纖維細胞 (WI-38 human lung fibroblast)當 作正常細胞，分別未處理及處理 30 µg/ml Rh2，培養 0-6 days，Trypan blue dye 染色後以血清計數器計算細胞數目。結果發現同樣濃度之 Rh2 會顯著抑制肺腺癌細胞的增殖，但對正常細胞存活之影響不大。
第二節 Rh2 使肺腺癌細胞週期停滯在 G1 期
過去的研究明確的指出，細胞的增生與分裂是遵循著一套規律的法 則稱之為細胞週期，整個週期可分為G1, S, G2 及 M 期，由上述實驗
過去的研究明確的指出，細胞的增生與分裂是遵循著一套規律的法 則稱之為細胞週期，整個週期可分為G1, S, G2 及 M 期，由上述實驗