中藥萃取
本論文所用的 98 種中藥材分讓自順天堂公司(表二)，中藥的甲 醇萃取過程如下：將中藥 3 公克加入 10 毫升的甲醇中，在室溫中萃 取 24 小時，再經-30℃冷凍解凍一次，取得中藥甲醇萃取物後，烘乾 並測量其溶質乾重。吳茱萸 4 種溶劑萃取過程如下： (1)沸水萃取物，
將水 10 毫升加熱至 60℃，10 分鐘後再加入中藥 3 公克，置於室溫 中萃取 24 小時，-30℃冷凍解凍一次，取得中藥水萃取物(2)酸性乙醇 萃取物、(3)水萃取物、(4)乙醇萃取物等，如同甲醇萃取物方式萃取。
細胞培養
本論文所用的肝細胞為 Chang/AP-1 及 HepG2/AP-1 重組細胞 株，這兩株細胞分別為含有 AP-1 結合序列/報導基因(luciferase)的 Chang liver 及 HepG2 細胞(賴，2001)，因此可藉由測定 luciferase 的 活性，評估 AP-1 的活性。重組細胞主要培養在含有 10%胎牛血清 (HyClone®) 的 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)(Life Technologies)中。
AP-1 活性分析
將 Chang/AP-1 及 HepG2/AP-1 重組細胞培養在 96 孔培養盤，於 37℃、5% CO2培養箱培養 24 小時，然後將培養基中 10%胎牛血清改 以 0.1% 培 養 24 小 時 ， 以 中 藥 萃 取 物 及 腫 瘤 促 進 劑 TPA(20 ng/ml)(Sigma®)刺激 Chang/AP-1 及 HepG2/AP-1 重組細胞，再檢測細 胞中 luciferase 的活性，以獲得細胞中 AP-1 的活性。Luciferase 活性 的測定參照 Luciferase Assay System(Promega®)之步驟，取 得細胞萃取 物後，以 FB15 luminometer 測量，其結果以 relative light unit(RLU) 來表示。
細胞存活率試驗
將細胞培養在 96 孔培養盤中置於 37℃、5% CO2培養箱中 24 小 時 ， 加 入 中 藥 刺 激 ， 再 分 別 加 入 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)染料及 0.1% SDS-HCl，最後利 用 570 nm 波長偵測吸光值量的變化，若是吸光度愈高，表示細胞活 性愈佳，反之則表示細胞活性愈低。
Anchorage-independent transformation assay(soft agar)
將 Chang/AP-1 或 HepG2/AP-1 重組細胞(1×104) 懸浮在 1 ml (35
agar(Difco®)的細胞生長培養基中，其中含 10%胎牛血清，最後將這 細胞層覆蓋在含 0.6 % agar 的 2 ml 細胞生長培養基上，將細胞培養 在 37℃ 、 5% CO2 培 養 箱 中 21 天 後 ， 利 用 50 ng/ml 的 ρ - iodonitrotetrazolium violet（INT）（Sigma®）染色 24 小時，最後拍照 並以電腦影像分析計數細胞群(colony)。
第三章、結果(Results)
中藥對由 TPA 所誘發 AP-1 活性之影響
為了探討中藥是否會對 TPA 所誘發的 AP-1 產生調控的作用，我 們從順天堂公司取得了 98 種中藥，並用甲醇進行萃取。之後將 98 種 中藥與 20 ng/ml 的 TPA 混合，同時加入 Chang/AP-1 細胞培養液中處 理 16 小時後，測其 luciferase 活性。由圖四(A) 結果顯示，部分中藥 的確可以在 Chang/AP-1 細胞中調控經 TPA 所誘發的 AP-1 活性。在 活化 AP-1 活性方面以射干的活化程度最明顯，其對 AP-1 的活化倍 率高於 200%。相反的，在抑制 AP-1 活性方面，以皂莢的作用最明 顯，其可將 AP-1 的活性降低至與背景值相同。另外可以抑制由 TPA 所誘發的 AP-1 活性達 50%以上的藥物有，麻黃、防己、吳茱萸、知 母、厚朴、紫草、大黃、苦參、檳榔與甘草。因此這部分實驗確實發 現部分中藥可以調控在 Chang/AP-1 細胞中由 TPA 所誘發的 AP-1 活 性。
為了了解這些中藥是否在其他肝細胞株中，也具有調節 AP-1 的 活性，因此我們利用 HepG2/AP-1細胞進行測試，在經過與 Chang/AP-1 細胞相同處理之後，測其 luciferase 活性。由圖四(B) 結果顯示，部 分中藥的確可以在 HepG2/AP-1 細胞中調控經 TPA 所誘發的 AP-1 活
化倍率高於 300%，相反的在抑制 AP-1 活性方面，以皂莢、苦參、
檳榔最為顯著，可將 AP-1 的活性降低至與背景值相同。進一步我們 選擇在 HepG2/AP-1 細胞中具有抑制 AP-1 活性的十味中藥，分別為 吳茱萸、天花粉、赤芍藥、烏梅、皂莢、大黃、青蒿、苦參、黃蓮、
黃柏做探討比較。
中藥影響由 TPA 所誘發的 AP-1 活性及細胞活性之劑量反應
我們將在 Chang/AP-1 及 HepG2/AP1 細胞中抑制 AP-1 活性排名 前 十 名 的 中 藥 ， 分 別 為 麻 黃 (Ephedra sinica) 、 吳 茱 萸 (Evodia
rutaecarpa)、厚朴(Magnolia officinallis)、大黃(Rheum officinale)、檳
榔 (Arcea catechu)、防己 (Stephanica tetrandra)、知母 (Anemarrhena
asphodeloids)、皂莢(Gledititsia sinensis)、苦參(Sophora flavescens)、
甘草(Glycyrrhiza uralensis)作進一步的分析。將 10 種中藥的六種藥物 濃度 10、20、30、40、50、100 μg/ml，加入以 20 ng/ml TPA 處理 的 Chang/AP-1 細胞中，培養 16 小時後，測量其 luciferase 活性(圖五)。
另外，為了了解這些藥物影響 AP-1 的活性是否是細胞毒殺效應，我 們將藥物濃度為 10、20、30、40、50、100、300μg/ml，加入 Chang/AP-1 細胞，培養 16 小時，再以 MTT 分析法，測量藥物對細胞的毒殺效應
較緩和之外，其餘隨著藥物濃度增加皆有很明顯的 AP-1 抑制作用。
在細胞毒性試驗中，隨著 10 種中藥濃度的增加，細胞的存活率卻也 隨之上升，表示藥物在適當濃度下對細胞不但沒有毒殺性，反而還有 促進增生的作用。另外從圖五也可以觀察出，在較低藥物濃度時，對 AP-1 活性有較好之抑制效果的藥物為厚朴(圖五-C)和防己(圖五-F)。
從上一個實驗所得到十種中藥對 AP-1活性及對細胞存活率的影 響結果，可以分別計算出每種藥物在 Chang/AP-1 細胞中抑制由 TPA 所誘發 AP-1 活性達一半時，所需的藥物濃度，即是 50% Effective inhibitory concentration (EC50)。十種中藥 EC50由大到小依序排名為大 黃、吳茱萸、麻黃、檳榔、苦參、防己、甘草、厚朴、皂莢，其中知 母無法計算出來(表三)。在藥物存在下，細胞致死量達一半時所需的 藥物濃度，即是 50% Toxicity concentration (TC50)，從表中可以看到十 味中藥裡有六味中藥的 TC50大於 300 μg/ml，分別為麻黃、吳茱萸、
知母、厚朴、大黃、檳榔。其餘的中藥，TC50由大到小依序排列為苦 參、甘草、防己、皂莢。將 TC50除以 EC50所得到的結果以 Selective index (SI)表示， SI 數值越大，表示藥物在可以抑制癌細胞的濃度下，其 他細胞並不會被藥物殺死，換句話說就是藥物的副作用越低。從表三 中可以看到在十味中藥裡面，SI 由大到小依序為厚朴、甘草、檳榔、
中藥對 TPA 所誘發肝細胞轉形之影響
為了了解上述具抑制 AP-1活性的中藥是否具有抑制肝細胞轉形 的能力，我們利用 anchorage-independent transformation assay 進行測 試。將 Chang/AP-1 細胞培養在 2 毫升含有 20 ng/ml TPA 0.4% agar 中，
再加入九種藥物的 EC50濃度作為治療濃度(麻黃 54.2 μg/ml、 防己 9.7 μg/ml、 吳茱萸 28.6 μg/ml、厚朴 27.3 μg/ml、皂莢 57.2 μ g/ml、大黃 47.9 μg/ml、苦參 30.1 μg/ml、檳榔 45.4 μg/ml、甘 草 39.8 μg/ml)，持續培養 21 天後，以 INT 染色 24 小時後拍照，結 果如圖六顯示。具有抑制 Chang/AP-1 細胞轉形的藥物有防己(圖六-D) 及吳茱萸(圖六-E)，其他藥物雖然也有抑制的傾向，但相對於對照組 並不明顯。
吳茱萸(Evodia rutaecarpa)不同批號對 TPA 所誘發 AP-1 活性的影響 經過不同細胞株(Chang/AP-1 與 HepG2/AP-1)的 AP-1 活性試驗 及 Chang/ AP-1 的細胞轉形試驗後，我們進一步選擇吳茱萸來分析。
首先分析不同來源的吳茱萸是否對 AP-1 具有相同的抑制作用，圖七 (A)顯示三種不同市售來源的吳茱萸在外觀上的差異，順天堂提供的
Chang/AP-1 細胞抑制 TPA 誘發 AP-1 活性的比率差異，結果顯示，順 天堂編號 287 和欣隆編號 507的吳茱萸從低濃度到高濃度皆有相同的 AP-1 抑制效果，欣隆編號 507 的中藥則對 AP-1 的抑制效果並不顯著。
吳茱萸(Evodia rutaecarpa)五種溶劑萃取物對 TPA 所誘發 AP-1 活性 的影響
為了探究哪一類成分負責吳茱萸抑制 AP-1 活性的能力，我們將 吳茱萸利用 5 種不同溶媒(酸性乙醇、乙醇、甲醇、水、沸水)進而萃 取之後，分別將 6 種濃度 0.2、1、5、25、125、625 μg/ml 的吳茱萸 5 種溶劑萃取物加入含 20 ng/ml TPA 的 Chang/AP-1 細胞中，培養 16 小時後，測量其 luciferase 活性。另外分別將上述五種濃度之藥物加 入 Chang/AP-1 細胞，培養 16 小時再以 MTT 分析法，測量藥物對細 胞的毒殺效應。圖八顯示吳茱萸的水及熱水萃取物，對 AP-1 的活性 並沒有明顯的抑制作用，而吳茱萸的甲醇萃取物、酸性乙醇萃取物和 乙醇萃取物皆對 AP-1 有明顯的抑制作用。在藥物對細胞的毒殺效應 的結果可以發現吳茱萸的水及熱水萃取物對細胞沒有明顯的毒殺效 應，而在甲醇、酸性乙醇及乙醇萃取物則更精準的測量出在 125 μ g/ml 藥物濃度則對細胞有明顯的毒殺效應。
吳茱萸甲醇萃取物對 TPA 所誘發肝細胞轉形之劑量反應
同 樣 利 用 anchorage-independent transformation assay 的 方 式 ， 將 Chang/AP-1 細胞培養在 2 毫升含有 20 ng/ml TPA 的 0.4% Soft agar 中，並加入 6 種不同濃度 0.2、1、5、25、125、625 μg/ml 的吳茱萸 甲醇萃取物，持續培養 21 天後，利用 INT 染色 24 小時後拍照。圖 九 顯示隨著吳茱萸濃度的增加，細胞團塊(colony)的大小和數量也隨 之減少。
表二、本研究所使用中藥之基本資料，分別列出中藥名、藥物英文學名及分類(科)
編號 中藥名 學名 分類
1 麻黃 Ephedra sinica Sttapf 麻黃科(Ephedraceae)
2 柴胡 Bupleurum chinense DC. 繖形科(Umbelliferae)
3 木通 Clematis montana Buch.-Ham. ;C. argentilucida W.T. Wang 馬兜鈴科(Aristolochiaceae)
4 豬苓 Polyporus umbellatus (Pers) Fries 多孔菌科(Polyporaceae)
5 秦艽 Gentiana macrophylla Pall. 龍膽科(Gentianaceae)
6 白芷 Angelica dahurica(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. var. formosana (Boiss.) Shan et Yuan
繖形科(Umbelliferae)
7 防己 Stephanica tetrandra S. Moore 防己科(Menispermaceae)
8 乾薑 Zingiber officinale Rosc. 薑科(Zingiberaceae)
9 吳茱萸 Evodia rutaecarpa(Juss.) Benth. ;E rutaecarpa (Juss.) Benth. Var.
officinalis(Dode) Huang
芸香科(Rut aceae)
10 石膏 Gypsum Fibrosum 礦物(Mineral)
11 知母 Anemarrhena asphodeloids Bge. 百合科(Liliaceae)
12 山梔子 Gardenia jasminoides Ellis 茜草科(Rubiaceae)
13 桑白皮 Morus alba L. 桑科(Moraceaae)
14 玄參 Scrophullaria ningpoensis Hemsl. 玄參科(Scrophulariaceae)
15 百合 Lilium lancifolium Thunb. ; L brownii F. E Brown var. viridulum Baker ; L. pumilum DC.
百合科(Liliaceae) 16 杏仁 Prunus armeniaca L.; Prunus armeniaca L. var. ansu Maxim. 薔薇科(Rosaceae)
17 貝母 Fritillaria thunbergii Miq. 百合科(Liliaceae)
18 天花粉 Trichosanthes. Kirilowii Maxim. ; T. rosthornii Herms 栝樓科(Trichosanthes)
19 紫苑 Aster tatricus L. f. 菊科(Compositae)
20 厚樸 Magnolia officinallis Rehd. et Wils. ; Magnolia officinallis Rehd. et Wils. var. biloba Rehd. et Wils.
木蘭科(Magnoliaceae)
21 枳實 Poncirus trifoliata Raf. 芸香科(Rutaceae)
22 赤芍藥 Paeonia lactiflora Pall. 牡丹科(Paeoniaceae)
23 桃仁 Prunus persica(L.) Batsch 薔薇科(Rosaceae)
24 澤蘭 Lycopus lucidus Turcz. var. hirtus Regel 唇形科(Labiatae)
25 當歸 Angelica sinensis (Oliv.) Diels 繖形科(Umbelliferae)
26 川芎 Ligusticum chuanxiong Hort. 繖形科(Umbelliferae)
27 白殭蠶 被 Beauveria bassiana (Bals.) Vaillant 感染致死之家蠶的乾燥蟲體 動物(animal)
28 山茱萸 Cornus officinalis Sieb. et Zucc. 山茱萸科(Cornaceae)
29 萆薢 Dioscorea hypoglauca Palibin 薯蕷科(Dioscoreaceae)
30 蒿本 Ligusticum sinense Oliv. 繖形科(Umbelliferae)
31 蒼耳子 Xanthium sibiricum Patr. 菊科(Compositae)
32 白茅根 Imperata cylindrica Beauv. Var. major (Nees) C. E. Hubb. 禾本科(Gramineae)
33 紫草 Arnebia euchroma (Royle) Johnst. 紫草科(Boraginaceae)
34 款冬花 Tussilago farfara L. 菊科(Compositae)
35 薤白 Allium macrostemon Bunge. 百合科(Liliaceae)
36 白芍藥 Paeonia lactiflora Pall. 牡丹科(Paeoniaceae)
37 淫羊藿 Epinmedium brevicornum Maxim. ; E. sagittatum(Sieb. et Zucc.) Maxim.
小蘗科(Berberidaceae)
38 狗脊 Cibotium barometz(L.) J.Sm. 蚌殼蕨科(Dicksoniaceae)
39 烏梅 Prunus mume(Sieb.) Sieb. et Zucc. 薔薇科(Rosaceae)
40 白鮮皮 Dictamnus dasycarpus Turcz. 芸香科(Rutaceae)
41 龍眼肉 Euphoria longana Lam. 無患子科(Sapindaceae)
42 合歡皮 Albizia julibrissin Durazz. 豆科(Leguminosae)
43 海蛤 Meretrix meretrix L. 豆科(Leguminosae)
47 半夏 Pinellia ternata (Thunb.) Breit. 天南星科(Araceae) 48 天南星 Arisaema erubescens (Wall.) Schott. ; A heterophyllum Bl. ; A.
amurense Maxim.
天南星科(Araceae)
49 旋覆花 Inula japonica Thunb. 菊科(Compositae)
50 萹蓄 Polygonum aviculare L. 蓼科(Polygonaceae)
51 刨附子 Aconitum carmichaeli Debx. 毛茛科(Ranunculaceae)
52 白芨 Beletilla striata(Thunb.) Reichb. f. 蓼科(Polygonaceae)
53 皂莢 Gledititsia sinensis Lam. 豆科(Leguminosae)
54 薄荷 Mentha haplocalyx Briq. 脣形科(Labiatae)
55 土茯苓 Smilax glabra Roxb. 百合科(Liliaceae)
56 板藍根 Isatis indigotica Fort. 十字花科(Cruciferae)
57 蛇舌草 Hedyotis diffusa Willd. 茜草科(Rubiaceae)
58 半枝蓮 Scutellaria barbata D. Don 脣形科(Labiatae)
59 蒲公英 Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz. 菊科(Compositae)
60 海藻 Sargassum pallidum (Turn) C. Ag. 馬尾藻科
61 大青葉 Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek. 十字花科(Cruciferae)
62 龍膽草 Gentiana rigescens Franch. 龍膽科(Gentianaceae)
63 大黃 Rheum officinale Baill. 蓼科(Polyporaceae)
64 白頭翁 Pulsatilla chinensis (Bge.) Regel 木犀科(Oleaceae)
65 連翹 Forsythia suspensa (Thunb) Vahl 木犀科(Oleaceae)
66 青蒿 Artemisia annua L. 菊科(Compositae)
67 苦參 Sophora flavescens Ait. 豆科(Leguminosae)
68 敗醬草 Thlaspi arvensis L. 敗醬草科(Valerianaceae)
69 魚腥草 Houttuynia cordata Thunb. 三白草科(Saururaceae)
70 金銀花 Lonicera japonica Thunb 忍冬科(Caprifoliaceae)
71 荊芥 Schizonepeta tenuifolia Briq. 唇形科(Labiatae)
72 升麻 Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim. 毛茛科(Ranunculaceae)
73 葛根 Pueraria lobata (Willd.) Ohwi 豆科(Leguminosae)
74 檳榔 Arcea catechu L. 棕櫚科(Palmae)
74 檳榔 Arcea catechu L. 棕櫚科(Palmae)