2-1 材料及設備
(一) 人類臍帶血細胞製備
1、人類臍帶血細胞（奇美醫學中心婦產部健康產婦自願捐贈）
2、Ficoll-Paque（Famacia Uppsala, sweden）
3、PBS （友和貿易股份有限公司）
4、細胞凍存液（生寶生物科技股份有限公司提供）
5、0.4％ Trypan Blue Stain（GIBCO Cell Culture）
(二) 動物實驗
1、 Sprague-Dawley (SD)品系之成年雄性大鼠（BioLasco Taiwan Co., Ltd）
2、Urethane（Sigma Chemical Co., St Louis ,U.S.A. ） 3、0.9% Saline
4、Heparin（30 unints/ml; Sigma Chemical Co., St Louis ,U.S.A. ） 5、聚乙烯管
6、手術器具及耗材：三通管、針筒、膠帶、18 號針頭、PE 管、止血鉗、
鑷子、棉花棒、剪刀、骨剪、棉線、縫線、顯微剪、瑞士鑷…等 7、10% 福馬林
8、30％ 蔗糖水
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(三)組織免疫染色實驗
1、100％、95％、75％、50％ Ethanol （台灣菸酒公賣局）
2、Xylene （Thermo）
3、Hematoxylin （Thermo）
4、Eosin （Thermo）
5、ApoAlertTM DNA Fragmentation Assay Kit （BD Biosciences-Clontech）
6、DAPI stain kit（Invitrogen）
(四)ELISA
1、TNF-α kit（R＆D systems, Inc.）
2、IL-10 kit（R＆Dsystems, Inc.）
3、Tween-20（Sigma-Alorich）
4、1％ BSA（Albumin fromborine serum, Sigma Chemical Co.,St Louis ,U.S.A.）
5、TMB substrate（Clinical Science Products Int.）
6、Stop solution（2N H2SO4）
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(五)、儀器設備
1、循環烘箱（DSO-300D）
2、電子式溫度偵測器（Thermometer, TES 1306, Taiwan）
3、-4℃ 冰箱（King Cool）
4、-20℃ 冰箱（Kenmore）
5、-80℃ 冰箱（Thermo）
6、超低溫高速離心機（himac, CF 16RX, HITACHI）
7、包埋機（Thermo）
8、循環式溫水浴槽、循環式折疊加熱毯（Tech-Cob Scientific, Sdn, Bhd, model 511）
9、石臘旋轉式切片機（Thermo）
10、螢光顯微鏡（Olympus, BX51）
11、倒立型顯微鏡（Nikon, ECLIPS, TE 2000-U）
12、送風式無菌操作台（造鑫企業有限公司）
13、抽氣櫃（Hipoint）
14、震盪器
15、ELISA reader（BOHEMIA）
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2-2 實驗模式與設計
2-2-1 人類臍帶血細胞
臍帶血是來自奇美醫學中心婦產部健康產婦自願捐贈，並通過人體試 驗委員會審查，在產婦及寶寶安全的條件下，順利分娩後充分消毒臍帶，
以臍靜脈穿刺採血，新鮮採集後立即送至奇美醫學中心醫學研究部，使用 Ficoll – Paque 依密度梯度的不同分離出單核球（buffy coat），也就是實驗 所需要的造血幹細胞，再以 0.4％ Trypan Blue Stain 以細胞計數器計算細 胞數量，接著以無血清細胞凍存液 (生寶生物科技股份有限公司提供) 將 細胞存放於 -80 °C 冷凍保存備用。在實驗進行至細胞治療前，取出保存 細胞去除細胞凍存液，使用 0.4％ Trypan Blue Stain 及細胞計數器，計算 出各組實驗所需之細胞數，使其懸浮在 0.3 ml 的 1X PBS 備用。
2-2-2 實驗動物
本研究使用 Sprague-Dawley (SD) 品系之成年雄性大鼠，體重介於 300±15g，由台灣台北樂斯科股份有限公司 (BioLasco Taiwan Co., Ltd) 所 購入，送達台南奇美醫學中心醫學研究部動物中心後，遵守國家衛生研究 院‖實驗動物飼養管理及使用指南‖和‖動物福利法‖，將其飼養於奇美醫學 中心醫學研究部研究大樓動物房，採獨立空調並給予 12 小時光/暗週期及
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恆定溫度(22±1℃)與濕度(55±5%)環境，以顆粒大鼠飼料及乾淨自來水供 其自由採食。
2-2-3 外科手術和生理參數監測
實驗首先，使用 Urethane 腹腔注射，劑量為 1.4 克/公斤來維持適當的 麻醉，在測試角膜反射和疼痛反射確定已阻斷痛覺之後，始進行實驗。使 用手術工具及聚乙烯管材（PE50）在大鼠右側股動脈和股靜脈進行插管手 術，完成後立即上機進行生理參數連續監測，監測項目包含使用熱電偶連 續監測核心溫度（Tco）、壓力感測器連續監測平均動脈壓（MAP）和心跳 頻率（HR）。在實驗的最後，所有組別的大鼠，將使用過量聚氨酯腹腔注 射犧牲。
2-2-4 誘導熱中風
麻醉動物的 Tco 均保持在約 36.5 ºC，以避免其失溫。常溫控制組，在 股動靜脈插管後，使其暴露在室溫下連續監測生理參數 480 分鐘或到所有 實驗結束。熱中風誘導組，是使用 43°C 恆溫的熱水循環式折疊加熱毯，
將動物置入其中加熱 70 分鐘，當 MAP 上升至最高點，並開始不可逆的下 降 25mmHg 時，此為熱中風的發病起始點(HS onset)。在熱中風發病後，
立即使動物回到室溫（攝氏 26°C）恢復。
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2-2-5 實驗分組及設計
將大鼠隨機分為如下 5 組，除常溫控制組外，在誘導熱中風(heatstroke;
HS)後給予治療。治療時間點：判定 HS onset 立即給予第一劑治療(此時間 點視為存活時間第 0 分鐘)，第 12 分鐘再給予第二劑治療。(N=6) 分組 如下：
(A) 常溫控制組(Normothermic control; NC)： 將大鼠置於室溫(Ta) 26 ℃之恆定環境，並連續監測其生理參數，時間約 480 分鐘或至其 他組別實驗結束。
(B) 熱中風控制組(Heatstroke + Saline 0.3 ml, i.v. + Saline 0.3 ml, i.v. ; HS+S2)：此組別為實驗性熱中風組控制組，連續監測大鼠的生理參數，
並將其暴露在 43 ℃恆溫環境下 70 分鐘，在判定熱中風後，立即停止 加熱，使大鼠回復到室溫 26 ℃，同時立即以靜脈注射給予 0.3 ml 的 生理食鹽水，並持續監測其生理參數及存活時間，在存活時間的第 12 分鐘，給予第二劑的 0.3 ml 生理食鹽水。
(C) 人類臍帶血幹細胞單劑+生理食鹽水治療之熱中風組(Heatstroke+
hUCBCs 5X105/ 0.3 ml, i.v. + Saline 0.3 ml, i.v. ; HS+H+S)：此組別為實
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驗性熱中風單次細胞治療組，連續監測大鼠的生理參數，並將其暴露 在 43 ℃恆溫環境下 70 分鐘，在判定熱中風後，立即停止加熱，使大 鼠回復到室溫 26 ℃，同時立即以靜脈注射給予人類臍帶血幹細胞 (5X105cells / 0.3 ml)，並持續監測其生理參數及存活時間，在存時間 的第 12 分鐘，給予第二劑的 0.3 ml 生理食鹽水。
(D) 人類臍帶血幹細胞連續兩劑治療之熱中風組(Heatstroke+ hUCBCs 5X105 / 0.3 ml, i.v. + hUCBCs 5X105 / 0.3 ml, i.v. ; HS+H2)：此組別為實 驗性熱中風連續兩劑細胞治療組，連續監測大鼠的生理參數，並將其 暴露在 43 ℃恆溫環境下 70 分鐘，在判定熱中風後，立即停止加熱，
使大鼠回復到室溫 26 ℃，同時立即以靜脈注射給予人類臍帶血幹細 胞(5×105cells / 0.3 mL)，並持續監測其生理參數及存活時間，在存活 時間的第 12 分鐘，給予第二劑的人類臍帶血細胞(5×105 cells/0.3 ml)。
(E) 人類臍帶血幹細胞結合兩劑單次治療之熱中風組(Heatstroke+
hUCBCs 1X106 / 0.3 ml, i.v. ; HS+H1)：此組別為實驗性熱中風結合兩 劑細胞單次治療組，連續監測大鼠的生理參數，並將其暴露在 43 ℃ 恆溫環境下 70 分鐘，在判定熱中風後，立即停止加熱，使大鼠回復 到室溫 26 ℃，以靜脈注射給予人類臍帶血幹細胞(1×106 cells / 0.3 mL)，
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並持續監測其生理參數及存活時間。
觀察上述各組大鼠在治療後的存活時間，(A)~(D)組做後續病理 切片及血清分析。
2-2-6 病理組織石蠟切片及染色分析 2-2-6-1 病理組織切片製作
將大鼠於熱中風過後 20 分鐘將其犧牲取下腦部組織做切片與染色。
首先必須手術打開胸腔，自右心房上端剪開心竇使血液可循環流出，並立 即將另一端事先接好灌流機的 18 號針頭插入左心室，以 400 ml 的 0.9% 冰 生理食鹽水進行全身性灌流換血，待流出的血液完全清澈時，立即停止灌 流，以手術骨剪打開腦殼，取下完整的大腦，將其浸泡於 10% 的福馬林 液 3 天，之後再將液體換為 30% 蔗糖水浸泡至組織沉澱(此為脫水步驟)，
接著將組織換回 10%的福馬林液完成最後的固定(post-fix)步驟，再送至病 理部進行二次脫水，完成後即可使用石蠟包埋機進行包埋，將組織嵌入蠟 塊中，冷卻即完成包埋。在切片前需預冷包埋好的大腦，再將其固定在切 片機上，進行 4 μm 厚度的冠狀(cross section)切片，切片區域為大腦下視 丘部分。將切好的石蠟組織薄片於 50 °C 溫水展開，貼附在事先以
poly-L-lysine solution coating 處理過的玻片上風乾，保存於玻片盒中備染。
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2-2-6-2 組織化學染色法 (Hematoxylin & Eosin stain; H&E stain) 及腦神 經細胞損傷指數 (Neuronal damage score ) 分析
蘇木精-伊紅染色，又稱為「H&E染色」（hematoxylin and eosin stain, HE stain, H&E stain），是組織學上最常用的染色方法之一。這種染色方法是依 組織結構對不同染料的結合程度不同而呈現出我們希望觀察到的組織區域。
蘇木精的顏色較深，可將嗜鹼性結構染成藍紫色，而伊紅染料顏色較淺而 略帶螢光色系，可將嗜酸性結構染成偏粉紅色。嗜鹼性結構通常包括含有 核酸的部分，如核糖體、細胞核及細胞質中富含核糖核酸（RNA）的區域 等。嗜酸性結構則通常為細胞質部分及細胞間的蛋白質。如果在製備組織 時灌流換血不夠乾淨或組織本身有色素，也會出現類似黃褐色的斑點。
首先，將玻片上已風乾的組織切片，以二甲苯和乙醇去除石蠟，再進 行H&E染色、封片，以顯微鏡觀察細胞型態。神經元損傷的程度選用改良 自Pulsinelli等人所發表提出之分級系統(58)，其中0分代表的是無損傷的正常 神經細胞，1分表示約有30％的神經細胞受損，2分表示約60％的神經細胞 受損，3分表示100％的神經細胞都受損。在蒙蔽審查員實驗條件下，每個 大腦半球獨立評估，以維持實驗的公平性和可靠度。
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2-2-6-3 Termial deoxynucleotidyl-trasferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling（TUNEL）& DAPI 細胞凋亡染色分析
TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-madiated dUTP-biotin nick end labeling）染色法，系購買商品化的試劑ApoAlertTM DNA
Fragmentation Assay Kit （BD Biosciences-Clontech），先將切片利用二甲 苯和乙醇去除石蠟，按照廠商建議的操作流程說明將腦組織的切片進行染 色，完成後再使用DAPI套組染色，以螢光封片膠封片，使用螢光顯微鏡觀 察並且拍照，以Image Pro-Plus影像分析軟體，計算量化出凋亡細胞在該區 域細胞數的比例。兩種染色之影像重疊（merge），可清楚辨識細胞凋亡的 區域及程度。
此染色原理是當細胞凋亡時，染色體 DNA 會斷裂(或稱為片段化)，
而產生大量3′-OH 黏性末端，利用去氧核醣核苷酸末端轉移酶（transferase）
將去氧核糖核苷酸和螢光素、過氧化物酶、鹼性磷酸酶或生物素形成的衍 生物標記到 DNA 的 3′-OH 末端，最後利用螢光激發呈色，偵測到綠螢光
（FITC）的部位即代表已凋亡的細胞。
2-2-7 發炎激素 TNF-α 和抗發炎激素 IL-10 之 ELISA 濃度分析
在實驗動物存活時間第 20 分鐘時，由股靜脈採血，並立即使用離心 機以-4 °C , 3500 rpm 離心 30 分鐘，取血清保存於-80 ℃備測。以市售 ELISA
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試劑盒，依照製造商的流程說明書測定，再立即以 ELISA reader 在 450 nm 之吸光值判讀結果，再將所得數據由標準曲線來計算，即可得知血清中 TNF-α 和 IL-10 的濃度 (pg / ml)。
2-2-8 數據統計及分析
所有實驗結果數據均以平均值±標準偏差（mean ± SD）表示。利用單 因子變異數分析（one-way analysis of variance; ANOVA），求得整個實驗組 別是否有差異性存在，並採用費雪（Fisher’s）檢定做事後分析，找出哪兩 組之間有顯著差異，所有結果均以 P＜0.05 表示具有統計意義。神經損傷 指標統計則利用 Wilcoxon signed-rank test 做排序，再配合以 Mann-
Whiteney test 檢測，表示法為中位數，所有結果均以 P＜0.05 表示具統計
Whiteney test 檢測，表示法為中位數，所有結果均以 P＜0.05 表示具統計