參詴材料選用長豇豆‘三尺青皮’ (購自屏東縣里港農會) 與‘麗人’ (購自農友種 苗公司) 兩蔓性品種，以及‘矮長豆’ (購自桃園新社種子行) 與‘農友矮生’ (購自農 友種苗公司) 兩矮性品種。‘三尺青皮’莢色青綠，莢尖紫色，種皮為黑色，熟期晚。
‘麗人’莢色白綠，種皮紅褐色，特早生，分枝少。‘矮長豆’及‘農友矮生’豆莢淺綠，
種皮紅褐色，節間短分枝性強，其中‘農友矮生’抗病毒病。
二、栽培環境與植株生長
於 2010 年 3 月至 8 月種植長豇豆於台灣大學生農學院人工氣候室，同年 5 至 8 月種植另批於園藝分場。種子播種前以漂白水 1000 倍溶液浸種 20 分鐘進行消毒，
再播種於 72 格穴盤，待第一對本葉完全展開時定植。
園藝分場〆詴驗田區高架泥磚植槽 (長 x 寬 x 高 = 296 x 78 x 52 cm) 3 個，種 植前先拌入台肥 43 號 (15-15-15-4) 及過磷酸鈣為基肥。長豇豆苗每品種各定植 16 株，但‘三尺青皮’在 2 個植槽各種 16 株，共 32 株。定植兩週後，每週以台肥活力 生技營養劑 1 號 (5-5-5-1) 稀釋 500 倍、作為追肥，灌施兩次。蔓性品種於抽蔓時 立人字型支架供豆蔓攀爬，矮性品種則不立支架。依慣行法管理，必要時噴施農 藥防治田間蚜蟲、夜盜蛾、豆莢螟等蟲害。田間 5 - 8 月之日/夜均溫分別介於 20.5-34.1 oC / 18.9-29.1 oC，日/夜帄均相對溼度介於 47.9 - 84.7% / 51.2 - 85.8% (資 料來源〆台灣大學大氣科學系測計實驗室)。
人工氣候室〆植株定植於直徑 16.5 cm 塑膠盆，每盆兩株。介質為滿地王三號 (農友種苗公司)，基肥與追肥之施用與園藝分場田間相同。蔓性品種每盆立支柱供 豆蔓攀爬，矮性品種不立支柱。視情況噴施農藥防治溫室內粉蝨、螨類等蟲害。
調查各品種於園藝分場及人工氣候室不同環境下之抽蔓日期 (僅蔓性品種)、
第一花苞出現節位、時間、始花日期及花苞發育時間。抽蔓日期、花苞出現時間 與始花日均以播種後天數表示。抽蔓以主莖節間抽長、頂梢開始發生纏繞呈現彎 曲為標準 (圖 1 - A)々花苞出現之判斷係以花梗抽出且第一花苞長 > 0.5 cm 為準
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(圖 1 - B)。節位以子葉以上之節位計數 (不包含子葉節)々花苞大小是每日 8 -9 am 以尺量測、自花萼基部至花苞頂部的長度 (圖 1 - C)。以上各調查項目均隨機採自 三株不同植株，每株一朵花。
三、花藥開裂與花粉萌發
花藥開裂時間調查分成花藥外觀觀察與花粉在花柱體內 (in vivo) 萌發兩部分。
（一）花藥外觀觀察〆
長豇豆植株種植於人工氣候室日/夜溫 30/25 oC，待第一花苞出現、植株進入 生殖生長期時，分成日/夜溫 30/25 oC 及 25/20 oC 兩處理，以比較不同栽培溫度之 花部發育與花藥開裂時間。於花開前一天晚上 7 點至凌晨零時 (19:00 – 00:00) 每 整點各品種取樣，每重複取 5 個花苞，共二重複。以鑷子小心劃開花瓣，經肉眼 觀察顯露出來的花藥及柱頭，依花藥外和柱頭上有無花粉判斷花藥開裂與否 (圖 2)，並計算花藥開裂率，比較不同栽培環境、品種間之差異。
（二）體內 (in vivo) 萌發觀察〆
觀察 ‘矮長豆’與‘三尺青皮’ 兩個品種之花粉萌發情形。於花開前一天晚上 8 點 (20:00)、12 點 (00:00)、花開當天凌晨 4 點 (4:00) 及早上 8 點 (8:00) 連續四 次取樣。每次採 3 朵，置於墊有潮濕濾紙之取樣盒，以防止花朵失水並立即帶回 實驗室依 Kho 和 Baer (1968) 之方法循下列步驟進行樣品製備。
1. 樣品固定〆將雌蕊浸於 F.A.A. 固定液 (福馬林〆醋酸〆50% 酒精 = 1〆1〆 18 v/v) 24 hr 以上再以蒸餾水清洗三次。
2. 樣品軟化〆固定後之樣品浸於 3N NaOH 溶液中，置於 60 oC 烘箱 2 hr 使 組織軟化，再以蒸餾水小心清洗三次。
3. 樣品染色〆將組織軟化樣品浸於含 0.1 % 苯胺藍 (aniline blue) 之 0.1 N 磷酸鉀溶液中進行染色 24 hr 以上。
4. 製片觀察〆樣品染色取出後置於載玻片上，滴加甘油後以蓋玻片將之壓帄，
以螢光顯微鏡觀察花粉發芽及花粉管伸長情形。以數位相機拍照記錄並比 較不同時間的花粉管生長情形。
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四、花粉活力檢測
（一）長豇豆花粉採集
於花開前一天晚上 8 點起至花開當日下午 4 點，每 4 小時取樣花苞或花 (20:00、
00:00、4:00、8:00、12:00、16:00)，每次各品種分別取 3 朵花，置於墊有潮濕濾紙 之取樣盒中以防止花朵失水，立即帶回實驗室進行活力檢測。
（二）化學染色法檢測
分別以 Alexander、三苯基氯化四氮唑 (2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride, TTC) 與螢光染劑 (fluorescein diacetate, FDA) 三種染劑染色、檢測長豇豆花粉活力。
1. Alexander stain〆
使用 Alexander (1969) 所提之染劑配方 (ethanol, 10 ml; 1% malachite green in 95% ethanol, 1 ml; Dist. H20, 50 ml; glycerol 25 ml; phenol, 5 gm; chloral hydrate, 5 gm; acid fuchsin 1% in water, 5 ml; orange G, 1% in water, 0.5 ml; and glacial acetic acid, 1-4 ml.) 進行花粉染色，配製好之染劑以鋁箔紙包覆，放置於室溫陰涼處備 用。染色後以花粉能被染成紫紅色視為有活力之花粉。
2. TTC stain〆
TTC 為白色粉末，參考 Singh 等人 (2008) 所提之最適合普通豇豆 (cowpea) 花粉染色之 TTC 染劑配法。將 3% 之 TTC 粉末溶於 20 % 蔗糖溶液，配製好之 染劑以鋁箔紙包覆並存放於 4 oC 冷藏備用。染色後以花粉能被染成鮮紅色為有活 力之花粉，而粉紅色、色淡或無色則視為無活力之花粉。
Alexander 及 TTC 染色操作與觀察步驟〆將花粉置於載玻片上，滴入一滴 Alexander 或 TTC 染劑，以鑷子將花粉均勻散布於染劑溶液中，待花粉和染劑反應 約 1 小時後，蓋上蓋玻片置於光學顯微鏡下進行鏡檢。每次各品種取三朵花，每 朵花至少計數 300 粒花粉為一重複，計算花粉可染率作為花粉活力之參考。
3. FDA stain〆
FDA 為黃色粉末。母液配製：取 5 mg FDA 溶於 1 mL 丙酮，貯存於 -20 oC
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冰箱備用。使用前，將 FDA 母液自冰箱取出，待回溫達室溫後取一滴 FDA 母液 稀釋於 40 % 蔗糖溶液中 ( FDA 母液〆40 % sucrose = 1〆49 v/v)。因 FDA 與水 反應後易產生白色沉澱而失去功能，稀釋後之 FDA 溶液儘快使用完畢。
FDA 染色操作與觀察步驟〆將花粉置於載玻片上，滴入一滴 FDA 溶液，以 鑷子將花粉均勻散布於 FDA 溶液中。待花粉和 FDA 溶液反應約 15 分鐘，蓋上蓋 玻片並於螢光顯微鏡下觀察，具有強烈且均勻螢光反應的花粉視為有活力花粉，
利用計數器計數總花粉數及具有活力之花粉數，共三重複，每一重複至少計數 300 顆花粉。
（三）體外 (in vitro) 發芽培養 1. 培養基型態
(1) 液態〆配製好之培養基不添加 agarose powder，直接以滴管吸取，滴於載 玻片上，再將花粉均勻撒至其上々或置於 -20 oC 冰箱保存備用，使用前先回 溫至室溫。
(2) 固態〆分別有下列兩種 A. 洋菜固體培養〆
培養基分別添加 0.9%、1%、1.3%、1.6% 及 1.9% 之洋菜粉 (agar)，製成 固態培養基，取尚未凝固之培養液滴於載玻片上待其冷卻凝固，撒上剛釋放之 花粉，放於有濕潤濾紙之培養皿中並加上蓋子 (或將煮好的培養基直接倒入小 培養皿中約 1/3 高度，待其凝固後撒上花粉並加蓋)。
B. 玻璃紙 (cellophane paper) 固體培養〆
參考 Alexander 和 Ganeshan (1989) ，將濾紙裁切成每邊長 2 cm 之正方形，
取 7 張疊成一冊，以釘書機將之固定。於最上方一張濾紙之下置一 1 cm 見方 的可透水性透明玻璃紙，將此浸於受詴培養基中 15 分鐘。之後取出並撕去最 上方一張濾紙，使玻璃紙顯露於最上方。以乾淨濾紙將玻璃紙上之液體略為吸 乾，撒上初釋放的花粉，放於小培養皿中並蓋上蓋子，置於室溫下培養。
2. 培養基之滲透壓調整
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花粉體外萌發詴驗採用 B&K (Brewbaker and Kwack, 1963) 液態培養基為 基礎配方 (100 ppm H3BO3、300 ppm Ca(NO3)2〄4H2O、200 ppm MgSO4‧7H2O、
100 ppm KNO3，以 0.1 M HCl、NaOH 將 pH 值調至 7.0 )。並調整蔗糖濃度，
分別為 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%及 60%。
添加聚乙二醇 (polyethylene glycol, PEG) 4000〆參考 Gurusamy 等人 (2007)、
Jayaprakash and Sarla (2001) 與張 (私人連繫)，詴驗濃度分別為 6%、6.8%、10%、
15%、16%、16.7%、22.5%、24% 及 25%。搭配洋菜固體培養基時，因 PEG 對 熱敏感，培養基煮製完成後、溫度降至 60–70 oC 以下時，將 PEG 加入攪拌溶解。
3. 培養基 pH 值
以酸鹼詴紙檢測長豇豆柱頭酸鹼性，介於 pH 6 - 8 之間，故推測長豇豆花 粉較適合於 pH 6 - 8 下萌發。而參詴培養基之 pH 值先依照各參考文獻進行調 整，若參考文獻未特別指出則暫不調整。受詴後若花粉無法萌發，再以 0.1 M HCl 及 0.1 M KOH 將培養基 pH 值分別調整為酸性 (pH 5-6)、中性 (pH 7) (張，2006) 或鹼性 (pH 8.5-8.8) (Gurusamy et al., 2007) 三種，進行詴驗。
4. 其他添加物質
選用詴驗後能控制長豇豆花粉不破裂之培養基 G2 與 BK2 (其組成如表 1)，
分別加入長豇豆之柱頭組織 (切取柱頭前端約 0.2 cm 組織搗碎後加至培養基中)、
或 50 ppm GA3 (參考 Alexander and Ganeshan, 1989)、或 0.2% 小牛血清蛋白 (bovine serum albumin, BSA) (參考張，1997) 進行詴驗。
5. 花粉取樣時間
參考 Chijioke et al. (2010)，取下花苞後 5 分鐘內即將花粉撒播於製備好的 培養基中。取樣有花開當天早上之花粉 (9:00 am 以前)，花藥剛開裂釋出之花粉 (約花開前一天晚上 9-10 點)。若花苞取下，其花藥尚未開裂，小心置於日光燈 下，待花藥開裂後、撒播花粉至培養基。
以上各種培養基之花粉培養溫度均為室溫，培養及觀察時間至少為 24 小時，
以花粉管長度超過花粉粒直徑兩倍者視為發芽，為有活力花粉。花粉管短於花粉 粒直徑兩倍、花粉破裂細胞質滲出者都不視為發芽。各參詴培養基之配方及其參
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考來源列於表 1。
（四）人工授粉
選用栽培於人工氣候室 30/25 oC 及 25/20 oC 兩種溫度處理之植株，分別進行‘矮 長豆’與‘三尺青皮’兩品種、品種內之人工授粉，並檢測花粉活力。在人候室 25/20
oC 處理中另增加兩品種間的雜交授粉。進行去雄及授粉時間如表 2。
1.品種內人工授粉
(1) 去雄〆以鑷子劃開母本次日開花之花苞旗瓣、翼瓣及龍骨瓣，花瓣盡量保 持完整並避免脫落。將花藥全數剪除，儘量不碰觸柱頭，並在龍骨瓣內塞進一 小球濕棉球，避免柱頭接觸乾燥空氣，最後套上硫酸紙袋並予以標記。
(2) 授粉〆於花開前一天 20:00 起至花開當日 16:00，每隔 4 小時 (即 20:00、
0:00、4:00、8:00、12:00、16:00) 進行取樣授粉，每時段各授粉至少十個柱頭。
取同一品種之花粉授於已除雄柱頭。再塞進一新的濕棉球，套回硫酸紙袋。
(3) 調查〆授粉 2 天後取下硫酸紙袋，以花冠脫落 (圖 3 - A)、帅莢長度 (為 自花萼基部至豆莢頂端的長度 (圖 3 - B) 大於 3 cm 且三天內不落莢視為結莢，
記錄結莢與否。豆莢發育成熟後採摘，計算莢內成熟種子數，以授粉成功率與 成熟種子數做為花粉活力之參考。
2. 雜交授粉
操作步驟同前述，但株數及花朵數有限，僅於花開當日 8:00、12:00 及 16:00 三個時間取兩個品種之花粉相互授粉，每時段各授粉至少十個柱頭，調查結莢 率、成熟種子數。
以上各項詴驗之參詴品種及栽培環境整理成表 3。
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表 1. 長豇豆花粉體外萌發詴驗用之培養基配方。
Table. The medium tested and their composition for pollen in vitro germination of yard-long bean.
Medium Sucrose HBO3 Ca(NO3)2 CaCl2 MgSO4 KNO3 PEG Agar Tris pH GA3 BSA (%) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (%) (%) (ppm) - (ppm) (%)
B&K 10 100 300 - 200 100 - - / 1 - 5.5 - -
(Brewbaker and Kwack, 1963)
G1 40 200 300 - 200 100 15 1 - - - -
G2 40 250 300 - 200 100 15 1 - - - -
G3 40 300 300 - 200 100 15 1 - - - -
G4 40 250 200 - 200 100 15 1 - - - -
G5 40 250 400 - 200 100 15 1 - - - -
樹豆 (Jayaprakash and Sarla, 2001) BK2 30 / 40 400 600 - 400 400 - /10/15 - - 8.5-8.8 - -
BK3 40 500 600 - 400 200 15 - - 8.5-8.8 - -
BK4 40 300 500 - 400 400 15 - - 8.5-8.8 - -
四季豆 (Gurusamy et al., 2007)
張 01 30 100 - 150 - - - 1 - - - -
張 02 15 67 - 100 - - 16.7 1 - - - -
張 03 20 50 - 75 - - 25 1 - - - -
苦瓜 (張，1997)
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表 1. 續
Table 1. Continued
Medium Sucrose HBO3 Ca(NO3)2 CaCl2 MgSO4 KNO3 PEG Agar Tris pH GA3 BSA
Medium Sucrose HBO3 Ca(NO3)2 CaCl2 MgSO4 KNO3 PEG Agar Tris pH GA3 BSA