3-1 試樣準備
本實驗使用六個月大的猪隻腰椎為試樣，試樣大小為一個運動單元(椎骨-椎間盤-椎骨)，總共取 36 個試樣 。試樣的處理方式為先取下猪腰椎，利用線鋸 機分成運動單元大小並移除後側椎骨小面關節部份，再利用手術刀將週邊的軟組 織剔除後，在椎骨的兩端利用補土包埋，包埋時會使用水平儀確保上下補土為水 平，主要是為了確保實驗時試樣能與實驗儀器保持平面接觸且為均佈荷載。之後 我們會將試樣分成兩組，一組為 intact 組(N=18)，一組為 denatured 組。intact 組 試樣為用紗布包上並噴上生理食鹽水保溼，先放入-20℃的冰箱中保存，在實驗 前 24 小時拿到 4℃的冰箱中解凍，解凍過程會將試樣浸泡在生理食鹽水中。椎 間核變性水解組需將試樣椎間核產生變性水解，而我們是採用胰蛋白酶(T4799，
Sigma)。注射前會將 0.5g 胰蛋白酶加入 99.5ml 的生理食鹽水中，均勻攪拌後成 0.5%胰蛋白酶溶液。注射時會使用 22G 號針頭將 1ml 的胰蛋白酶溶液由四個不 同方向等量注入試樣中，如圖 3-1 所示為注射時四個入針方向(A、L、P 和 R)。
為了確保胰蛋白酶溶液與椎間核產生作用，會將注射完的試樣先放於室溫 25℃
下 12 小時，再放入 4℃冰箱保存 12 小時，實驗前 2 小時拿到室溫下退冰，以上 過程皆會將試樣浸泡在生理食鹽水中。
圖 3-1、入針方向示意圖
A
R P
L
A
3-2 實驗流程
本實驗測試的椎間盤損傷模型會分成椎間核變性水解與椎間環損傷模型兩 種，椎間核變性水解模型在動態性質測試時會施予短時間的循環負載(30 分鐘)；
椎間環損傷模型在動態性質測試時會施予短時間的循環負載(2 小時)，以下章節 會加以詳細介紹整個實驗流程。
3-2-1 椎間核變性水解模型流程
本實驗的流程如圖 3-2 所示，試樣未受循環負載之前會先作衝擊測試，再施 予第一次 30 分鐘循環負載，循環負載期間每 10 分鐘會一次作衝擊測試。完成第 一次循環負載後會將試樣分成兩組，一組(n=9)為直接浸泡生理食鹽水放入 4℃冰 箱 24 小時保存，實驗前 2 小時拿到室溫下退冰，再施予第二次 30 分鐘循環負載，
同樣每 10 分鐘分鐘會一次作衝擊測試，此組稱為 control group；另一組(n=9)為 使用 22G 號針頭由之前入針方向注入 1ml 的梔子素溶液後(078-03021，Wako，
Japan)，為了確保梔子素溶液與椎間核產生作用，會先注射完的試樣先放於室溫 25℃下 12 小時，再放入 4℃冰箱保存 12 小時，實驗前 2 小時拿到室溫下退冰，
再施予第二次 30 分鐘循環負載，同樣每 10 分鐘分鐘會一次作衝擊測試，此組稱 為 crosslinking group。梔子素溶液濃度為 0.33% (0.33g 加入 99.67ml 的生理食鹽 水調配而成)。
3-2-2 椎間環損傷模型流程
本實驗的流程如圖 3-3 所示，試樣未受循環負載之前會先作衝擊測試，再施 予第一次 2 小時循環負載，循環負載期間在 0.5、1 和 2 小時會一次作衝擊測試。
完成第一次循環負載後會將試樣分成兩組，一組(n=9)為直接浸泡生理食鹽水放 入 4℃冰箱 24 小時保存，實驗前 2 小時拿到室溫下退冰，再施予第二次 2 小時 循環負載，同樣在 0.5、1 和 2 小時會一次作衝擊測試，此組稱為 control group；
另一組(n=9)為直接浸泡梔子素溶液後(078-03021，Wako，Japan)放入 4℃冰箱 24 小時保存，實驗前 2 小時拿到室溫下退冰，再施予第二次 2 小時循環負載，同樣
在 0.5、1 和 2 小時會作一次衝擊測試，此組稱為 crosslinking group。梔子素溶液 溶度為 0.33% (0.33g 加入 99.67ml 的生理食鹽水) 。
圖 3-2、椎間核變性水解組流程圖
圖 3-3、椎間環損傷組流程圖 3-3 實驗方法
衝擊測試.本實驗的衝擊測試高度為 1 公分的衝擊試驗，所產生的衝擊能量 為 1.2J，緩衝墊使用 20ms 的材料。如圖 3-4 所示，首先會將試樣擺放在 CITA
健康正常椎間盤 (N=18)
循環負載
0.5,1,2小時
衝擊測試 衝擊測試
Control group (N=9)
Crosslinking group ( N=9) 2小時
變性水解椎間盤 (N=18)
循環負載
10,20,30分鐘 衝擊測試 衝擊測試
Control group (N=9)
Crosslinking group ( N=9) 30分鐘
機台上且與機台同軸心後，利用 C 型夾將試樣補土固定在上下兩個一維測力元 中，再將緩衝墊固定在撞擊承受器上面，接著利用 1 公分的塊規去調整衝擊錘固 定座，使的衝擊錘底部與緩衝墊距離為 1 公分。
循環負載.就上述試樣衝擊完後，會將緩衝墊拿掉，將衝擊錘放置撞擊承受 器上，接著將往復式衝擊模組放入衝擊錘上固定，如圖 3-4 所示。循環負載力量 平均為 420 牛頓(範圍為 190~590 牛頓)，負載頻率 5Hz，循環負載時間總共分為 短時間與長時間的兩種。短時間循環負載為總共為 30 分鐘，循環次數為 9,000 次，並每 10 分鐘間隔會做一次衝擊測試。短時間循環負載為總共為 2 小時，循 環次數為 36,000 次，並會在 0.5 小時、1 小時及 2 小時時做一次衝擊測試。
圖 3-4、實驗時機台示意圖
底座 撞擊承受器
循環負載模組
固定架 衝擊錘 掛鉤 固定架
線性電位計 導引桿
試樣
一維測力元 C型夾
一維測力元
一維測力元 緩衝墊
3-4 數學模型
椎間盤是一個黏彈性的材料，所以就將椎間盤視為一個彈簧阻尼系統，如 圖 3-5 所示，其一維自由震盪運動方程式為如式 3-1 所示。式中質量體( M )為包 含衝擊承受器、上補土及椎骨的重量，總重約為 9 公斤。勁度係數K(stiffness) 與阻尼係數C(damping coefficient)即為椎間盤的動態性質。本實驗量測資料為椎 間盤受衝擊時的位移量變化，如圖 3-6 所示。第一個峰值為衝擊錘衝擊錘過程，
圖 3-6、椎間盤位移與時間關係圖 3-5 統計分析方法
椎間核變性降解/外生性交聯的影響
先使用 Two-way ANOVA 來分析椎間核變性降解前、椎間核變性降解後、椎 間核變性降解並產生外生性交聯後，椎間盤的勁度、阻尼係數於循環負載期間的 差異。兩個主要的分析因子為「椎間核特性」以及「循環負載的時間」。椎間核 變性降解前的實驗資料則是取自實驗室資料庫，該資料已被刊登至 SPINE 期刊
7。接著，採用 One-way ANOVA 來檢驗循環負載是否對椎間核變性降解後之椎 間盤產生無法回復的破壞。如果檢定結果為否定，則取第二次循環負載後的實驗 數據並使用 Two-way ANOVA，來分析椎間核產生外生性交聯之後椎間盤的勁 度、阻尼係數於循環負載期間的變化，並與健康椎間盤做比較。以上兩次 Two-way ANOVA，最後皆以 LSD 法做後設分析。所有統計檢定皆以 p<0.05 視為達顯著 性差異。
椎間環斷裂/外生性交聯的影響
使用 Two-way ANOVA 來分析椎間環斷裂前、椎間環斷裂後、椎間環斷裂 並產生外生性交聯後，椎間盤的勁度、阻尼係數於循環負載期間的差異。兩個主 要的分析因子為「椎間環特性」以及「循環負載的時間」。接著以 LSD 法針對該 兩個主要因子做後設分析。以上統計檢定皆以 P<0.05 視為達顯著性差異。
X1
τ d
自由震盪期間
衝擊期間
X2