第二章 材料與方法
2.2 使用藥品、有機溶劑
2.4.2 溶劑空白試驗(solvent blank test)
以萃取所用之溶劑正己烷純品打入 GC-FID 分析，以確保 不含任何干擾實驗之物質。
2.4.3 DBP 回收率測定
取已知濃度的DBP加入微生物液體培養基中，以正己烷萃取後，取2μl 以GC-FID進行分析，計算萃取回收率。
2.4.4 儀器與方法偵測極限
由高濃度到低濃度注射2μl 的 DBP 標準品到 GC-FID 中進行樣品分析，
當 DBP 濃度到達儀器本身可偵測及積分的最低濃度時，即為該儀器的儀器 偵測極限。
2.4.5 DBP 儲備標準液(stock solution) 之製備：
秤取0.1000 克之 DBP 置於10 mL 之定量瓶中，加入丙酮至定量刻線，
即終濃度為10000 mg/L，避免光照，以parafilm封口，冷藏於4°C備用。
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2.4.6 製作檢量線：
將標準溶液進行稀釋成 1、5、10、30、50 mg/L，取2μl注射入 GC-FID 分析，將所得之層析面積對濃度值作線性回歸，以取得相關係數值與回歸 方程式，作為分析樣本時之濃度計算依據。
2.5 底泥降解實驗
2.5.1 Dibutyl phthalate 分解菌的培養與馴化
將底泥取樣回來後，立刻取200g之土壤加入含有800C.C.無機鹽液體培 養基和5ppmDBP於一公升之血清瓶中，至於黑暗中30°C，每隔15天秤取1g 酵母萃取物與葡萄糖液於新鮮的培無機鹽培養液中(含5ppmDBP)進行培養 與馴化。
2.5.2 降解純菌培養
DBP降解純菌“Deinococcus radiodurans”分離自高雄中油煉油廠之活性 污泥設備，經分析確定具有DBP降解能力。配置R2A培養基，1 公升RO水 含有bacto yeast extract 0.5g，bacto proteose peptone No.3 0.5g，bacto casamino acid 0.5g，bacto dextrose 0.5g，soluble starch 0.5g，sodium pyluvate 0.3g，
potassiu phosphate,dibasic 0.3g，magnesium sulfate 0.05g，bacto agar 15g。秤 18.2g 溶於一公升RO水中，經滅菌後使用，以四區劃線法培養於培養基中，
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置於黑暗中30°C的培養箱中，之後每隔七天，在以四區劃線法化現於新鮮 培養基中進行純化培養。
2.5.3 萃取分析方法
取培養不同天數的樣本加入 20 ml的 n-hexane，以試管震盪混合器震 盪 約 2分 鐘 後 ，再 用 低速 離 心機 (3200rpm)離 心 10分 鐘 ， 便 可 清楚 分 辨 n-hexane與樣本培養液，取上清液於附有鐵氟龍蓋螺旋試管中，以上步驟重
複一次，便取得40ml之萃取液，最後樣本中再加入 10 ml的 n-hexane，再 以相同步驟萃取，取得50ml萃取液。取 2ml 到GC分析樣本瓶中，以GC-FID 分析 DBP 濃度。
2.5.4 DBP 之 GC-FID 分析條件
本實驗分析DBP所使用的氣相層析儀為美國 Hewlett-Packard 公司製，
型號：HP 4890 G2690A，偵測器：火焰離子偵測器，型號HP-5(Crosslinked 5% PH ME Siloxane)毛細管柱，長15m，內徑0.53mm。攜帶氣體為氮氣，氣 體流速 30 mL / min、氫氣，氣體流速 30 mL / min、空氣，氣體流速 400 mL
/ min；注入埠溫度 240°C，注入量 1.0 μL，偵測器溫度 300°C，層析溫度：
最初溫度 180°C，保持 1分鐘，升溫速率：10°C / min，最終溫度 300°C，
保持 2分鐘，共15分鐘。
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2.5.5 不同地點底泥降解實驗比較
系統配置：於125 mL 之血清瓶中加入45 mL 之滅菌好氧基礎培養基，
與 5g 底泥，並加入使最終濃度為 5 ppm之DBP，以好氧之透氣塞封瓶於 30 °C下培養。
土壤樣本為高雄縣仁武鄉後勁溪水管路段之河川表土，採樣點共有四 個，分別為A、B、C、D，每個定點相隔150公尺，以上每一試驗組皆二重 複，並以 GC-FID 追蹤不同時間點的 DBP 殘餘量。
2.5.6 取樣不同地點混合菌種與滅菌底泥降解 DBP 測試
將取樣土壤 A、B、C、D 四點混合在一起滅菌，為避免菌種再生，所 以滅菌三次，防止菌種滋生，滅菌完後稱之為滅菌底泥。將 125 mL 之血 清瓶中加入 45 mL 之滅菌好氧基礎培養基，與 5g 滅菌底泥，以好氧之透 氣塞封瓶於 30°C下培養，以 GC-FID 追蹤不同時間點的 DBP 殘餘量。
2.5.7 分析不同 DBP 濃度降解試驗
將 125 mL 之血清瓶中加入 45 mL 之滅菌好氧基礎培養基，與 5g 底 泥，分別添加不同 DBP 濃度 1、5、10、30、50 mg/L(ppm) ，共五組。以 好氧之透氣塞封瓶於 30oC下培養，以 GC-FID 追蹤不同時間點的 DBP 殘 餘量。
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2.5.8 分析不同培養溫度 DBP 降解試驗
將125 mL 之血清瓶中加入 45 mL 之滅菌好氧基礎培養基，與 5g 底 泥，並添加濃度 5 ppm DBP 於血清瓶中，分別在20、25、30、35、40°C 培養箱中黑暗培養，共五組。並以好氧之透氣塞封瓶，以 GC-FID 追蹤不 同時間點的 DBP 殘餘量。
2.5.9 分析靜置培養與震盪培養 DBP 降解試驗
將125 mL 之血清瓶中加入 45 mL 之滅菌好氧基礎培養基，與 5g 底 泥，並添加濃度 5 ppm DBP 於血清瓶中，分別靜置培養於黑暗培養箱中
30°C，另一組則培養在震盪儀上以轉速 160 rpm，溫度 30oC培養，共兩組。
並以好氧之透氣塞封瓶，以 GC-FID 追蹤不同時間點的 DBP 殘餘量。
2.5.10 分析添加不同比例的酵母萃取物與葡萄糖液 DBP 降解試驗
將125 mL 之血清瓶中加入 45 mL 之滅菌好氧基礎培養基，與 5g 底 泥，並添加濃度 5 ppm DBP 於血清瓶中，分別添加酵母萃取物 0.25g (A 組)；酵母萃取物 0.15g，葡萄糖液 0.125g (B組)；酵母萃取物 0.15g，葡萄 糖液 0.0625g (C組)；酵母萃取物 0.15g，葡萄糖液 0.03125g (D組)，培養 於黑暗，30°C培養箱中，共四組。並以好氧之透氣塞封瓶，以 GC-FID 追 蹤不同時間點的 DBP 殘餘量。
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2.5.11 分析不同 pH值微生物降解 DBP 試驗
將125 mL 之血清瓶中加入 45 mL 之滅菌好氧基礎培養基，與 5g 底 泥，並添加濃度 5 ppm DBP 於血清瓶中，分別以 NaOH 溶液與 HCl 溶 液調配 pH值，pH值為 pH 5、6、7、8、9，培養於黑暗，30°C培養箱中，
共五組。並以好氧之透氣塞封瓶，以 GC-FID 追蹤不同時間點的 DBP 殘 餘量。
2.5.12 分析添加降解純菌與不添加降解純菌 DBP 降解試驗
將125 mL 之血清瓶中加入 45 mL 之滅菌好氧基礎培養基，與 5g 底 泥，並添加濃度 5 ppm DBP 於血清瓶中，分別添加 4 mL Deinococcus radiodurans 菌液於培養液中，另一組則無添加Deinococcus radiodurans 菌
液於培養液中，培養於黑暗，30°C培養箱中，共兩組。並以好氧之透氣塞 封瓶，以 GC-FID 追蹤不同時間點的 DBP 殘餘量。
2.5.13 生物降解速率之計算
降解速率=(DBP 原始濃度-殘餘濃度) / (降解總天數-遲滯期) 其中濃度: mg/L
時間: day
降解速率= mg/L/day
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2.5.14 化學動力學之計算
將生物降解實驗結果代入一級反應式表示如下：
rate=k[A]
ln[A]t=-kt+ln[A]o
[A]t為化合物在時間為t時之濃度。
[A]o為化合物於反應起始之濃度。
以此方程式求出反應常數k值，以求出反應半生期t1/2：
t1/2=0.693/k
2.6 水樣急毒性檢測方法－水中葉綠素 a 檢測方法－乙醇萃取法
2.6.1 藻類生長測定方法概要
水樣經過濾於玻璃纖維濾片後，以乙醇萃取其中之葉綠素
a
，再 以分光光度儀測得萃取液在酸化前和酸化後之吸光值，最後依吸光值 計算水樣中葉綠素a
含量。38
2.6.2 適用範圍
本方法適用於事業、都市放流水或其他廢污水以及池塘、河川、湖泊、
水庫及海域等水中所含葉綠素
a
之急毒性試驗。2.6.3 干擾
(1) 葉綠素 a 之分解產物，如脫鎂葉綠素(Phaeophytins)及脫鎂葉綠甲酯一 酸(Phaeophorbide a)，因其吸收波長與葉綠素 a 相近，會產生干擾，可利 用加酸後扣除吸光值予以校正之。
(2) 測試使用之器皿有不乾淨時，會造成結果上的誤差。
(3) 浮游植物內之其他色素，如葉綠素 b
、
c 含量高時會產生干擾。(4) 樣品具濁度時會產生干擾。
2.6.4 基礎培養液
用於藻類培養急毒性測試之基礎培養液，其 pH 值須控制在 7.00~7.40，
其組成如下：
藥品名稱
NaNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MgCl2、CaCl2·2H2O、NaHCO3，以 上為 Fe-EDTA 溶液(註 1)。H3BO3、MnCl2、CoCl2、CuCl2(註 2)、Na2MoO4、 ZnCl2。
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以上藥品均購自於友和貿易股份有限公司。
(註 1) Fe-EDTA 溶液單獨滅菌，再與其它培養液混合。
(註 2) 微量元素(H3BO3、MnCl2、CoCl2、CuCl2、Na2MoO4、ZnCl2)需做二次稀釋以減 少誤差，故需取 1000 倍表列克數配製(全部配成一升)後再加以稀釋。
2.6.5 供試生物
採用綠藻類單細胞小球藻(Chlorella vulgaris Beij.)，品系編號＃3001，
供試生物之培養如下：
(1)將藻細胞於基礎培養液中，然後在與毒性測試相同之培養條件下培養三 天以上，進行馴養活化。馴化時間之光照採光暗比為 14:10 小時。
(2)未進行試驗之種藻培養液須定日進行稀釋，使小球藻培養液之葉綠素 a 濃度維持於 1.00~10.0 ppb 之間，以保持藻細胞於對數生長期。
2.6.6 連續性藻類培養方式(Continuous culture technique)
連續式培養系統包括連續供應新鮮的基質到反應槽中，使藻類處於最佳 生長的狀況，並連續將槽中新陳代謝物質排出槽外。此系統相當類似於自 然水體，因低濃度的營養鹽不斷的注入基質中，而所加入的營養鹽與藻類 生長產生一動力平衡。
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2.6.7 小球藻毒性測試步驟
1. 利用 Pipet 由血清瓶中間取出 0.5 mL 之藻液加入 Well 中 (盡量取中間部 分之藻液，維持每次取藻液位置相同)，另外再加入待測物質 0.5 mL，
需保留 3 孔只添加 100%藻液(0.5 mL 100%藻液，0.5 mL RO 水)作為對 照組。最後將 Well 放入迴旋震盪器震盪 24 小時並照燈光。
2. 將 Well 中之待測物質與小球藻原液以Pipet吸出放入離心管中，並放入 離心機以3500轉以上離心15分鐘，由離心管底部可看到綠色小球藻沉澱，
將上清液倒出，倒入90%酒精10ml。
3. 放入恆溫水槽中加熱 30 分鐘。
4. 將離心管取出至冰水中急速冷卻，冷卻至管壁變涼。
5. 離心管管壁變涼後，再將離心管放入離心機離心 15 分鐘。
6. 此時開始調校分光質譜儀歸零動作，先用分光質譜儀專用之 5 公分光徑 之測光管加入 10ml 的 90%酒精，用分光質譜儀測其在波長 665 及 750 nm 之吸光值，分別為 E665a 和 E750a，重複歸零三次。
7. 取出玻璃盒倒掉10ml的90%酒精，並用RO水清洗測光管，擦拭乾淨。
8. 小心取出離心管，避免震動，把待測物倒入測光管中，用分光質譜儀測 其在波長 665 及 750 nm 之吸光值，分別為 E665a 和 E750a。
9. 添加0.01mL HCl溶液於5cm光徑之測光管中，搖混1分鐘後靜置，5~30 分鐘內重新測量其在665及750nm之吸光值，此分別為 E665b和 E750b。
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2.6.8 空白分析值
每一批樣品須以一片不含葉綠素
a
之玻璃纖維濾片，依上述步驟，與 樣品同時做空白分析，並在波長 665 及 750 nm 測定其吸光值；樣品在波 長 665 及 750 nm 之吸光值均須分別扣除此空白分析值才是實際之吸光 值。2.6.9 結果換算 濁度校正：
樣品在 665 nm 之吸光值扣除在 750 nm 之吸光值即為校正後的吸光 值：
校正後的吸光值 C665a ＝ E665a - E750a 校正後的吸光值 C665b ＝ E665b - E750b 水樣之葉綠素
a
濃度：經濁度校正後，用下列公式計算水樣之葉綠素
a
濃度(Ca，μg /L)。Ca ＝29.62 (C665a - C665b ) × Ve / 5 Vs
式中 Ve 為所用乙醇體樍(mL)﹐Vs 為水樣體積(L)。
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2.7 品質管制
1. 萃取液在波長 665 nm 之吸光值應介於 0.01~ 0.8 之間，否則須調整水 樣過濾體積或改用較長光徑之測光管。
2. 若水樣呈酸性，則必須立刻過濾，以避免葉綠素 a 在酸性條件 下分解。
3. 測定過程必須在弱光下進行﹐並使用不透明容器以避免葉綠素 a 分 解。
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第三章 結果與討論
3.1 實驗品管
3.1.1 空白溶劑試驗
為確保本試驗所使用之正己烷(n-hexane)不會干擾實驗結果，將高純度 正己烷以GC-FID 分析後實驗結果如圖3-1，可知本研究中所使用的溶劑並 不會影響實驗的正確性。
為確保本試驗所使用之正己烷(n-hexane)不會干擾實驗結果，將高純度 正己烷以GC-FID 分析後實驗結果如圖3-1，可知本研究中所使用的溶劑並 不會影響實驗的正確性。