為瞭解缺鈣水稻幼苗經熱休克前處理對後續鎘逆境之影響，缺鈣水稻幼苗分 別經HS (45℃) 與 non-HS (30℃) 處理 3 小時，再移到含或不含氯化鎘 (5 μM) 水 耕液處理6 天後，分析第二片葉片之黃化程度與 MDA 含量。結果顯示，正常水耕 幼苗經HS 前處理可減緩後續鎘引起的葉片黃化與 MDA 含量之增加。缺鈣處理之 幼苗經HS 前處理不影響後續鎘造成之第二片葉片黃化與 MDA 含量之增加 (圖 32)。
SOD (units mg-1 protein)
APX (unit mg-1 protein)
0.0
GR (units mg-1 protein)
0.0
Cd (μg g-1
DW
)
0 5 10 15 20
_ +
b
a
+
c c 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
b
a
c c
A
B
Treatment
CdCl2 ( 5 μM, 6 d ) _
Control - Ca
圖 30. 缺鈣與氯化鎘處理對水稻幼苗地上部 (A) 與根 (B) 鎘含量之影響。待正 常與缺鈣處理之幼苗生長至第三片葉片完全展開後，移至含與不含5 μM 氯化鎘 水耕液，6 天後進行分析。每一處理為 4 重複。垂直線距表示標準機差。以 LSD 統計分析方法進行顯著性測驗。相同字母表示無顯著差異 (P<0.05)。
圖 31. HS 與缺鈣處理對水稻幼苗第二片葉片 Oshsp17.3 基因表現之影響。待正 常與缺鈣處理之幼苗生長至第三片葉片完全展開後，黑暗下HS (45℃) 及 non-HS (37℃) 分別處理 1 小時。(Oshsp17.3 之 cycle 數為 29)
MDA (nmol g-1 FW)
Control - Ca
圖 32. HS、缺鈣與鎘處理對水稻幼苗外表型態與第二片葉片 MDA 含量之影響。
討論
前人研究顯示鎘毒害會造成油菜葉片黃化 (Baryla et al., 2001)、高粱、茄子與 蕃茄地上部乾物重下降 (Khan and Khan, 1983; Pinto et al., 2004)、抑制豌豆地上部 與根部生長、減少側根數目與造成根細胞死亡 (Sandalio et al., 2001; María et al., 2006)、綠豆葉綠素降解 (Somashekaraiah et al., 1992) 。於水稻方面，鎘會抑制水 稻幼苗根長、根鮮重及冠根形成 (Chen and Kao, 1995a, 1995b; Xiong et al.,
2009) 、影響水稻葉片鮮重及乾物質累積、葉綠素及蛋白質降解與 MDA 含量增加 等情形 (Hsu and Kao, 2003b, 2005)。本論文之試驗材料可分為水稻黃化幼苗根系統 與幼苗系統。於水稻黃化幼苗根系統係以根長、根鮮重、根乾重、根細胞死亡程 度與冠根數目做為鎘毒害指標，於幼苗系統則以第二片葉片黃化程度、葉綠素、
蛋白質與MDA 含量做為鎘毒害指標。試驗結果顯示，於水稻黃化幼苗根系統，鎘
會抑制其根長、根鮮重、根乾重、冠根數目與增加細胞死亡程度 (圖 1、圖 11、
圖 18)；於幼苗系統，鎘會造成水稻幼苗第二片葉片黃化、葉綠素及蛋白質降解與 MDA 含量增加 (圖 26、圖 28)。以上試驗結果證明鎘處理確實對水稻黃化幼苗根 與水稻幼苗造成毒害。
一、 過氧化氫於水稻黃化幼苗根鎘逆境下所扮演之角色
本研究室過去證明水稻幼苗第二片葉片之鎘毒害係過氧化氫累積所造成 (Hsu and Kao, 2007b)。白三葉草根經鎘處理也可觀察到過氧化氫累積情形 (Wang and Song, 2009)。本論文於水稻黃化幼苗根之過氧化氫分析係以 TiCl4化學法與螢
光影像偵測法測定。由試驗結果發現，水稻黃化幼苗根於鎘處理6 小時後顯著增
加過氧化氫含量與螢光影像表現 (圖 2、圖 3)，此螢光表現可藉由添加過氧化氫
之清除劑AsA 消除或外加過氧化氫而增強，顯示表現之螢光具過氧化氫專一性。
進一步之螢光影響偵測結果更顯示過氧化氫於鎘處理2 小時即開始增加 (圖 4)。
DPI 為 NADPH oxidase 抑制劑，使過氧化氫含量下降 (圖 9D、圖 10) 可減緩鎘 所造成黃化幼苗根根長、根乾重之抑制與根細胞傷害之增加(圖 9A-C)。黃化幼苗 根直接處理不同濃度之過氧化氫，可使根長、根乾重與細胞死亡程度等鎘毒害指
標隨處理濃度增加而加劇 (圖 12)，顯示鎘對水稻黃化幼苗根造成根長及根乾重抑
制與細胞死亡程度增加之鎘毒害係因過氧化氫累積所導致。也顯示Cd 所造成之過
氧化氫累積部分原因為NADPH oxidase 被活化。 Xiong 等人 (2009) 研究結果指 出，鎘抑制水稻冠根數目與長度可視為鎘毒害指標之一。他們發現鎘處理會抑制 水稻根內生NO (nitric oxide) 含量，同時鎘所抑制之水稻冠根數目係由 NO 所調 控。本論文欲瞭解鎘所抑制之水稻冠根數目是否也與鎘誘導過氧化氫累積有關。
前處理DPI 使內生過氧化氫含量下降但不影響冠根數目之結果說明，鎘抑制水稻 冠根數目並不是受氧化氫所調控 (圖 11)。
DPI 前處理無法完全抵銷鎘誘導之過氧化氫累積 (圖 9D、圖 10)，顯示可能 有別的機制參與其中。鎘亦會影響抗氧化系統之平衡，阿拉伯芥經鎘處理會增加 根之抗氧化酵素CAT、APX、GR 基因與抗氧化物 GSH 含量 (Smeets et al., 2009)，
豌豆根經鎘處理則會抑制之抗氧化酵素CAT 活性、提高 SOD 活性與 GSH/GSSG rario 與 AsA/DHA ratio (María et al., 2006)。本論文之試驗結果發現水稻黃化幼苗根 經鎘處理3 小時後，CAT 活性 (圖 5) 及 GSH 含量下降 (圖 6)。CAT 活性下降與 GSH 含量下降可能導致後續過氧化氫含量顯著增加。本研究室之前研究顯示增加 GSH 含量可減緩水稻黃化幼苗根之鎘毒害 (Chen and Kao, 1995a)，本論文之試驗 結果則發現前處理GSH 使內生之 GSH 含量增加 (圖 7)，可減緩後續水稻黃化幼 苗之鎘毒害 (圖 8)。依上述試驗結果顯示水稻黃化幼苗之鎘毒害係因鎘導致 CAT
活性下降與GSH 含量下降，無法清除多餘過氧化氫而使過氧化氫累積，過多的過
氧化氫會導致根長、根乾重之抑制與細胞死亡程度增加而造成鎘毒害。
二、 鈣對水稻黃化幼苗根鎘逆境之調控
前人研究發現，鈣添加可減緩對萵苣鮮重與根長之抑制 (He et al., 2005)，減 緩鎘對花豆生長抑制、葉綠素降解 (Skórzyńka-Polit et al., 1998)，減緩鎘對玉米生 長抑制、葉綠素降解 (El-Enany, 1995)，減緩鎘誘導豌豆葉片過氧化氫增加 (Rodriguez-Serrano et al., 2009)，減緩鎘對挪威雲杉根乾重之抑制 (Österås and Greger, 2006)、減緩鎘對白三葉草根生長與 CAT 活性之抑制並降低 MDA 含量 (Wang and Song, 2009)。本論文試驗結果發現，添加鈣可減緩鎘對水稻黃化幼苗根
長之抑制 (圖 13)。添加鈣可使鎘處理增加之黃化幼苗根鎘含量減少。上述結果顯 示，鈣減緩鎘對根長之抑制係因鎘吸收量下降所致。本論文第一部分之結果顯示，
水稻黃化幼苗根之鎘毒害係因鎘抑制CAT 活性使過氧化氫累積所致，鈣添加後可
使鎘抑制之CAT 活性恢復 (圖 17D)、過氧化氫含量下降 (圖 15、圖 16) 與鎘毒 害 (根長、根乾重、冠根數目、與細胞死亡程度) 減緩 (圖 17A-C、圖 18)。鈣減 緩鎘抑制之根長與根乾重及鎘增加之細胞死亡程度可再經外加過氧化氫處理而加 劇，再度證明水稻根鎘毒害係因過氧化氫累積所導致。綜合第一與第二部分論文 之結果，顯示添加鈣可以減緩水稻黃化幼苗根之鎘毒害，其主要機制係減少水稻
根對鎘之吸收，恢復鎘抑制之CAT 活性而清除較多過氧化氫，以減緩過氧化氫對
根長、根乾重之抑制與增加細胞死亡程度之傷害，但鎘對冠根數目之抑制不受過 氧化氫影響。
圖 33. 鈣與過氧化氫對水稻黃化幼苗根鎘毒害之影響機制。↑表示增加，↓表示 下降。
Cd
CAT↓
GSH↓
NADPH oxidase↑
↓
H2O2↑↓
Ca
Cd toxicity↑
Root length↓
Root dry weight↓
Cell death↑
Cd toxicity↑
Crown root number↓
NO?
三、 缺鈣對水稻幼苗鎘毒害之影響
鈣為植物必需大量元素之一，為構成細胞壁、中膠層之組成份，具有穩定細 胞膜系及強化植物組織功能 (Jarvis, 1984)。細胞質內鈣離子可作為二次訊息直接 與目標酵素結合或是與攜鈣素結合後改變酵素活性調節細胞生理反應 (Hepler and Wayne, 1985)。過去研究顯示，番茄缺鈣會降低葉綠素含量 (Schmitz-Eiberger et al., 2002)，菠菜缺鈣會造成外表型黃化與降低鮮重及乾重 (Liu et al., 2009)，玉米缺鈣 會降低地上部與根部乾物質累積但不影響葉綠素含量 (Kumar Tewari et al.,
2004)。本論文試驗結果發現，水稻幼苗於缺鈣情況下 (圖 21) 抑制地上部與根部 生長 (圖 19、圖 20)，但不影響第二片葉片之鮮重、蛋白質與葉綠素含量 (圖 22)。
其可能原因為缺鈣會強烈影響植物生長點分化 (Jones and Lunt, 1967)，且鈣於植物 內移動性低，缺鈣病徵較易在幼嫩組織出現 (Dobermann and Fairhurst, 2000)。本 論文試驗結果亦發現，水稻幼苗第二片葉片之鈣含量遠高於地上部 (扣除第二片葉 片) 之鈣含量 (圖 21)，顯示因移動性低，鈣多分布於第二片葉片，因此於第三片 葉片完全展開時水稻幼苗第二片葉片尚未受鈣含量降低影響。
前人研究顯示，毛地黃細胞培養於缺鈣情況下，會降低CAT、APX 與 GR 活 性及GSH 含量但誘導 SOD 活性提升 (Paranhos et al., 1999)。玉米缺鈣會提高 CAT 與APX 活性 (Kumar Tewari et al., 2004)。番茄缺鈣會降低 SOD 活性與 AsA 含量 (Schmitz-Eiberger et al., 2002)。菠菜缺鈣會降低 SOD、APX、CAT 活性與 GSH/GSSG ratio (Liu et al., 2009)。本論文試驗結果發現，缺鈣可增加第二片葉片 SOD 活性與 比活性、降低CAT 活性與比活性 (圖 23、圖 24) 及降低 GSH 含量與 GSH/GSSG ratio (圖 25)。上述結果顯示缺鈣會削弱水稻幼苗第二片葉片之抗氧化系統防禦能 力。Gong 與 Li (1995) 發現玉米胚內之 SOD 活性受 CaM 調控，但 CAT 與 peroxidase 則不受CaM 影響。本論文之試驗結果發現缺鈣使得 CAT 活性下降與 SOD 活性提 升，但不會造成過氧化氫累積與 (data not shown)，推測可能原因為缺鈣可能影響 其他參與過氧化氫生合成之酵素活性調控，如NADPH oxidase、peroxidases…等，
使得整體過氧化氫含量不改變。
由於作物於實際田間栽培過程中鮮少遇到單一逆境，Mittler 於 2006 年提出多 重逆境之概念，指出多重逆境間具交互作用，對植物產生的影響可能不盡相同。
本研究室過去曾探討高溫、缺氮、缺硫、或缺鎂對水稻鎘逆境之影響，結果發現 高溫、缺氮與缺硫會加劇水稻幼苗之後續鎘毒害，缺氮與缺硫會削弱水稻幼苗之 抗氧化系統防禦能力而不耐後續鎘逆境 (Hsu and Kao, 2008; 林雅琳, 2008; 郭俊 伶, 2008)。缺鎂則可增加抗氧化系統防禦能力而減緩水稻幼苗後續鎘毒害 (周庭卲, 2009)。本論文之結果發現，缺鈣會減弱水稻幼苗抗氧化系統，因此加劇後續鎘逆 境之鎘毒害。缺鈣水稻幼苗與正常水稻幼苗相較，外表型黃化更為嚴重 (圖 26)、
加劇影響葉綠素、蛋白質、MDA 含量等鎘毒害指標 (圖 28A-C) 並增加鎘誘導提 升之過氧化氫含量 (圖 27、圖 28D)。同時可以發現，缺鈣幼苗經後續鎘處理會增 加鎘所誘導之SOD、APX、GR 與 CAT 比活性提升及 AsA 含量降低之增加 (圖 29)，同時增加鎘吸收 (圖 30)。前人研究結果也發現，花豆於低鈣情況下生長經 後續鎘逆境，亦會加劇鎘毒害與增加鎘吸收 (Skórzyńka-Polit et al., 1998)。推測可 能原因為鎘可經由鈣離子通道進入植物體 (Laetitia et al., 2002)，且鈣也參與調控其 他離子通道 (Ward and Schroeder, 1994; Bush, 1995)，缺鈣亦會影響其他離子平衡。
故於缺鈣時，可與鎘競爭通道之離子減少有利於植物吸收鎘。
故於缺鈣時，可與鎘競爭通道之離子減少有利於植物吸收鎘。