癌細胞轉移過程

癌細胞的轉移伴隨著細胞外基質的降解，以下先介紹細胞外基質的組成。

一、細胞外基質之組成與功能

細胞外基質(Extracellular matrix, ECM)位於細胞周圍，除了作為細胞與細胞間支 撐與固定的複雜結構體，也在調節細胞的正常生理活動過程扮演著重要角色。ECM 主要由三種生物分子組成(圖 1-2)：(1)蛋白多醣(proteoglycan)：為 ECM 的主要成份，

由一個核心蛋白(c o r e p r o t e i n )加上多個葡萄氨聚醣(glycosaminoglycans, GAGs) 所組成；(2)結構蛋白: 包括膠原(collagen)、彈性蛋白(elastin)，這些蛋白可形成堅韌

的 三 股 螺 旋 結 構 纖 維 ； (3) 特 殊 蛋 白 ： 層 黏 連 蛋 白 (laminin) 和 纖 維 黏 連 接 蛋 白 (fibronectin)，主要可以增加細胞和其他細胞或基底膜的黏附能力，與細胞的固定、

分化、運動、型態有關(Weber, 1992; Yurchenco and Schittny, 1990)。

細胞膜表面可同時表現多種黏著蛋白，黏著蛋白本身不但具有接受器之功能，

稱為黏著蛋白接受器(cell-adhesion receptor)，亦可作為其它細胞黏著蛋白接受器之配 基(ligand)，與其進行交互作用，其中，細胞與 ECM 則主要透過插入素蛋白(integrins) 傳遞細胞與細胞間各項訊息(Weber, 1992)。

在一般胚胎發育、組織重塑(tissue remodeling)、傷口癒合或懷孕等過程中細胞 會釋放一些蛋白質分解酶，如(1)基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)；

(2)絲胺酸(Serine)蛋白酶；(3)半胱胺酸(cysteien)蛋白酶；(4) Aspartyl 蛋白酶(Melchiori et al., 1992)，以維持蛋白質正常代謝與細胞生理功能。然而，惡性腫瘤細胞所分泌 的蛋白質分解酶雖與正常細胞相似，但其無法正常調控蛋白質分解酶的分泌量，進 而促進癌細胞發生轉移。目前已知當蛋白質分解酶分泌異常時會導致各種病理過 程，包括類風濕關節炎，骨關節炎，血管生成，侵襲和癌轉移(Chambers and Matrisian, 1997; Egeblad and Werb, 2002)。

圖 1-2.細胞外基質的組成 資料來源: (kentsimmons.uwinnipeg.ca)

圖 1-3.腫瘤細胞侵犯基底膜步驟 (Ramzi s. Cotran, 1999/6) 。

二、癌細胞轉移

造成乳腺癌患者致死的主要因素大都是癌細胞轉移至其他組織和器官所引起 (Woessner, 1991)，完整的癌細胞轉移是經過一連串複雜的步驟，其中包括了黏附 (adhesion)、侵入( invasion)、遷移(migration)三個主要階段(Nicolson, 1988)，腫瘤細 胞在轉移的過程中需要蛋白質分解酶降解細胞外基質，當癌細胞穿透基底膜後才可 經由淋巴或血液循環轉移至其他組織或器官，其轉移過程如下列敘述：(圖 1-4) 1. 轉形(Transformation)：正常細胞經由變成轉型細胞(transformed cell)，當癌細胞

不斷增殖後形成原發腫瘤(primary tumor)。

2. 分開(Detachment)：癌細胞彼此間鬆開；癌細胞會降低與其他細胞間吸附力 (cell-cell adhiesion)及與細胞質間的附著力(cell-matrix adlhesion)，因而使它們與 原病灶分開。

3. 附著(Attachment)：腫瘤細胞產生黏連並侵犯基底膜。

4. 侵襲(Invasion)：癌細胞降解細胞外基質後會侵入血管及淋巴管內和宿主淋巴細 胞交互作用，並與血小板形成腫瘤細胞栓子。

5. 移行(Migration)：腫瘤細胞栓子經循環系統黏附到別處的基底膜，存活的癌細胞 就能停留在新的組織或器官。

6. 血管新生(Angiogenesis)及生長(Growth)：腫瘤細胞在被轉移器官之組織中移行、

增生，並產生轉移瘤(micrometastasis tumor)，此時，轉移瘤會藉由血管新生作用 得以在新的組織或器官繼續生長，最後造成腫瘤細胞遠端器官或組織的轉移。

圖 1-4.腫瘤細胞轉移步驟 (資料來源: nature.com) 。 第三節 基質金屬蛋白酶和轉移的相關性

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)為一超級蛋白家族，其酵素活 性在調節人體正常生理與病理活動過程中扮演重要角色。研究證據證實腫瘤生長、

癌細胞轉移、侵襲及血管新生作用皆與基質金屬蛋白酶活化有關，因此，基質金屬 蛋白酶常被作為人類癌症臨床診斷及治療的重要指標之一。

基質金屬蛋白酶屬於鋅依賴性的蛋白家族，幾乎能降解各種細胞外基質的結構 (Roy et al., 2009)，圖 1-5 為基質金屬蛋白酶之蛋白質結構。

圖 1-5 基質金屬蛋白酶之蛋白質結構(Roy et al., 2009)。

根據基質的不同 MMPs 主要可分成四大類包括：(1)膠原蛋白酶；(2)明膠酶；

(3)基質溶解酶；(4)膜型基質金屬蛋白酶， 以及其它未被分類的蛋白分解酵素如(表 1-5) (Nelson et al., 2000)。

（1） 膠原蛋白酶 (Collagenases)：主要是降解纖維型的膠原蛋白，包括interstitial collagenase (MMP-1)、neutrophil collagenase (MMP-8)、collagenase-3 (MMP-13) 及xenopus collagenase (MMP-18)。

（2） 明膠酶(Gelatinases)：主要降解第四型膠原蛋白，此為基底膜主要成份，包括 gelatinase A (MMP-2)及 gelatinase B (MMP-9)。

（3） 基 質 溶 解酶 (Stromelysins) ： 包 括 stromelysin-1 (MMP-3) 、 stromelysin-2 (MMP-10)、stromelysin-3 (MMP-11)、matrilysin (MMP-7)。

（4） 膜型基質金屬蛋白酶 (Membrane-type MMPs)：包括MT1-MMP (MMP-14)、

MT2-MMP (MMP-15) 、 MT3-MMP (MMP-16) 、 MT4-MMP (MMP-17) 和 MT5-MMP (MMP-21)。

（5） 其它：包括Enamelysin (MMP-19、MMP-20、MMP-23和MMP-24)。

表 1-5. MMPs 的種類(Nelson et al., 2000) 。

MMPs 都有相似的結構，從 N 端起分別有 signal peptide、propeptide、catalytic 和 C 端的 hemopexin-like 等四個 domains，MMPs 合成後是以非活化態的型態 (Proenzyme)分泌，此時 propeptide domain 高度保留胱胺酸殘基(cysteine residue)，它 們以氫硫鍵與 catalytic doamin 上的鋅離子結合，使 MMPs 維持在未活化的狀態，活 化 MMPs 需要先要將連接於 cysteine 和鋅離子之間的鍵結打斷，半活化狀態的 MMPs 要再將 propeptide domain 切斷，顯露出鋅離子，才可成為具有生理作用活性 MMPs(active form)(Nagase and Woessner, 1999; Nelson et al., 2000)。活化的過程中會 將 MMPs 結構中 N 端的 propeptide domain 切除，而失去 10kD 的分子量 (Nagase, 1997; Ries et al., 2007)。

MMP-2和MMP-9主要為降解基底膜中的第四型膠原蛋白(type IV collagen)，其 與癌症的侵襲及轉移最具相關性(Brinckerhoff and Matrisian, 2002) (圖1-3)。曾有文獻 指出MMP-2持續大量表現在高度轉移的腫瘤細胞，而MMP-9可透過生長因子，例 如：epidermal growth factor(EGF)、transforming growth factor beta (TGF-β)(Ramirez et al., 2011)；促發炎細胞激素，例如：tumor necrosis factor-α (TNF-α)(Youn et al., 2011)；

紫外線輻射(Kimura and Sumiyoshi, 2011)或12-O-Tetradecanoyl-phorbol-acetate (TPA)(Lin et al., 2008a)誘發其表現。研究證實，MMP-9 promoter具有NF-κB和AP-1 binding site(Chung et al., 2004)且誘發NF-κB和AP-1 trans-activation與增加MMP-9表 現有關(Garg and Aggarwal, 2002; Lee et al., 2007)。

TPA 為一種 phorbol ester，是腫瘤促進劑(tumor promoter)同時也是蛋白質激酶 C kinase, MAPK)、磷酸肌醇 3-激酶(phospho-inositol 3-kinase,PI3K)及 PKC 等傳訊路徑 調控轉錄因子 NF-κB 和 AP-1 活化，進而促進 MMP-9 之表現(Blumberg, 1988)。

第四節 Mitogen-Activated protein Kinases (MAPKs)與轉移的相關性

MAPKs屬於serine/threonine kinases蛋白家族，當細胞受到外來刺激時，會藉由 MAPK訊息傳遞路徑，將胞外訊號傳遞到細胞核，進而調控與細胞發炎反應

(inflammination)、增生、分化、凋亡(apoptosis)及轉移等相關基因表現(Hammaker and Firestein, 2010; Johnson and Lapadat, 2002)。MAPKs級聯反應(cascade reaction)包括3

個順序的活化過程為：MAPK kinase kinase (MAPKKK)、MAPK kinase (MAPKK)及 MAP kinase 如(圖1-6)。每一種激酶由不同成分所組成，MAPKKK由C-RAF1、

MEKK1、MEKK2、TAK1等組成，MAPKK由MEK1/2、MKK1、MKK4、MKK5和 MKK6等組成，MAPK包括ERK 1/2 (extracellar signal-regluatedkinase)，JNK/SAPK (c-Jun NH2-terminal kinase)以及p38 MAPK (Johnson and Lapadat, 2002)。

圖 1-6. 有絲分裂原活化蛋白激酶的級聯反應(Hammaker and Firestein, 2010) 。 當 ERK、JNK 和 p38 被活化時，會促進 NF-κB 和 AP-1 等轉錄因子的活化(Force and Bonventre, 1998)，許多研究中已證實可透過活化 MAPKs 訊息傳遞路徑上調 MMP-9 的表現(Hsieh et al., 2010; Hwang et al., 2011b)，因此抑制 MAPKs 路徑可能與 抑制癌細胞侵襲及轉移有關，以下將介紹 ERK1/2、P38 與 JNK 路徑:

(1) Extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2)：

主要有兩種異構體，分子量分別為 42 kDa 及 44 kDa，ERK 的角色主要是調控 細胞的有絲分裂及分化，其可被生長因子、細胞激素、病毒感染和致癌蛋白 Ras 磷 酸 化 而 活 化 ， 而 激 活 的 Ras 則 經 由 phosphorylation cascade 依 序 活 化 Ras/Raf/MEK/ERK 進而刺激細胞不斷增生及分化，這亦是造成腫瘤細胞轉移的重要 因子之ㄧ(Johnson and Lapadat, 2002)。在轉移機制方面，有文獻指出植物化學物質

(quercetin)能透過抑制 PKC/ERK/AP-1 路徑磷酸化而減少 TPA 所誘導的 MMP-9 表 現，進而抑制 MCF-7 人類乳癌細胞侵襲和轉移之能力(Lin et al., 2008a)。

(2) c-Jun N-terminal kinase/stress activated protein kinase (JNK/SAPK)：

主要分為三種異構體：JNK1、JNK2及JNK3；JNK1和JNK2分子量分別為46 kDa 及54 kDa，它們普遍分佈於細胞和組織中，而JNK3 (57 kDa)主要表現於腦部、心臟 及睪丸。當細胞受到細胞激素、生長因子或環境壓力(UV照射、熱休克、氧化壓力 和高滲透壓)等刺激，會透過誘發上游MAPKK4 (MKK4/SEK-1)及MKK7的磷酸化，

進一步磷酸化活化下游的JNK訊號傳遞，調控細胞生長、分化、凋亡及轉移(Barr and Bogoyevitch, 2001; Johnson and Lapadat, 2002)。

研究指出洋丁香(Common Lilac)中的acteoside 可以經由抑制JNK磷酸化進而減

少NF-κB的轉錄活化作用，降低MMP-9表現，達到抑制人類纖維肉瘤細胞(HT-1080)

轉移之能力(Hwang et al., 2011a)。因此，JNK MAPK訊號傳遞路徑在調控癌細胞轉 移過程也扮演著重要的角色。

(3) p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAP kinase)：

主要有 α、β、γ 及 δ 四種異構體，細胞在受到發炎的細胞激素、UV 照射、熱

休克和高滲透壓等刺激，會透過磷酸化上游的 MKK3 及 MKK6 而活化下游的 p38MAPK。p38 也被證實在調控發炎因子、細胞凋亡與生長上扮演重要角色(Johnson and Lapadat, 2002)。在 p38 調控轉移機制方面，曾有文獻指出紅辣椒中的活性成分 辣椒素(capsaicin)可經由下調人類纖維肉瘤細胞中 p38 MAPK 磷酸化及 AP-1 的轉錄 活化作用，而減少表皮生長因子所誘導的 MMP-9 表現(Hwang et al., 2011b)。

第五節 PI3-kinase (phosphatidylinositol 3-kinas)/Akt 與轉移的相關性 Phosphatidylinositol 3-kinaes (PI3Ks) 是一種脂質激酶(lipid kinase)，會將 phosphatidylinositol (PI)的3’-OH位置磷酸化(Fruman et al., 1998)，其家族包括Class I、II、III三大類。哺乳動物的ClassⅠ酵素依結構和功能的不同有可分為IA、IB兩類，

IA由催化次單位p110與調節次單位p85組成異質二聚體，可受酪胺酸激酶接受器所

活化，而IB次家族由p110γ催化次單位與p101調節單位組成，可受G protein偶合接受 器(G protein-coupled receptor)所活化(Katso et al., 2001)。P-Akt也稱為蛋白激酶B (protein kinase B, PKB)，包括Akt1、Akt2和Akt3 (或PKBα/β/γ)三個異構體 (Hers et al., 2011)。在細胞中活化的PI3K將細胞膜Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2)磷酸 化成phosphatidyl-inositol-3,4,5-trisphosphate (PIP₃)，PIP3會與Akt的Pleckstrin

homology domain (PH domain)結合，使Akt遷移至細胞膜附近，隨後

3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1)及mammalian target of rapamycin complex 2 (mToRC2)與Akt結合並將Akt蛋白的Ser473和Thr308兩個氨基磷酸化(圖 1-7)，進而調控細胞生長、增殖和凋亡等作用(Hers et al., 2011)。有許多文獻指出，

活化PI3K/Akt訊號路徑與黑色素瘤、乳腺癌與胃癌進展呈現正相關性 (Dai et al., 2005; Nam et al., 2003; Perez-Tenorio and Stal, 2002)。

圖1-7. Akt 的調節與活化(Hers et al., 2011) 。

第六節 轉錄因子 NF-κB 與 AP-1 對 MMP-9 基因表現的影響

MMP-9基因的表現主要與NF-κB與AP-1兩種轉錄因子的活化有關(圖

1-8)(Hwang et al., 2010)。

圖1-8. 人類MMP-9基因啟動子區域的調節元素(Hwang et al., 2010) 。

（1） NF-κB：

核轉錄因子NF-κB最初在B淋巴細胞中被發現，其與免疫球蛋白kappa light chain enhancer region上的B位置特定序列GGGACTTTCC結合(Verma et al., 1995)以調控 kappa light chain的轉錄，因而稱之細胞核轉錄因子kB。NF-κB家族含有五種次單元 包括Rel A (p65)、Rel B (p68)、c-Rel (p75)、NF-κB1 (p50)與NF-κB2 (p52)，能形成不 同組合的同質雙聚體(homodimer)或異質雙聚體(heterodimer)，其中最常見的為 p65/p50的NF-κB異質雙聚體(De Martin et al., 2000)。細胞未受刺激時NF-κB存在細胞

質中並與活性抑制蛋白IκB (包括：IκB-α、IκB-β與IκB-γ)結合而呈現不活化狀態，當

細胞受到刺激，IκB-α會受到IKK (IκB kinase) complex磷酸化修飾，磷酸化的IκB-α 隨即被泛素-蛋白酶體系統 (ubiqutin-proteasome system)所降解，IκB-α便脫離

NF-κB，使NF-κB釋出具有活性的次單元由細胞質進入細胞核中，透過與目標基因

啟動子之NF-κB基因結合位置結合，進行各種基因的轉錄調控作用 (圖1-9)(Hiscott et

al., 2001)。研究證據證實，NF-κB在調控細胞發炎、免疫、細胞黏附因子、細胞凋

亡與細胞遷移等過程中扮演重要角色。有文獻指出，與腫瘤侵襲與轉移高度相關的 MMP-2和MMP-9基因啟動子上皆含有NF-κB轉錄因子的結合位置(Hwang et al., 2010)。

圖 1-9. IκB 影響 NF-κB 調控路徑(Hiscott et al., 2001)。

（2） AP-1：

轉錄因子AP-1調控許多細胞生理反應，包括細胞生長、分化和凋亡，其組成是 由Jun family (c-Jun、v-Jun、Jun B 及Jun D)、Fos family (c-Fos, FosB, Fra-1及Fra-2）

或其他含有basic region-leucine zipper (bZIP) domain的蛋白質，例如：ATF(包含ATF2, B-ATF, JDP1及JDP2)和Maf (包含Maf A, Maf B, c-Maf及Maf G/F/K)，以同質雙聚體 或異質雙聚體形式存在(Mechta-Grigoriou et al., 2001)細胞質中，AP-1的轉錄活性與