第二章 文獻探討
2. 白血球徵募作用
動脈粥狀硬化損傷形成的最初期步驟是白血球的徵募作用
(recruitment)，而黏著分子及細胞激素在這過程中扮演重要的角色。白血 球的徵募作用 (圖2.4) 主要包括下列步驟：(1)透過與選擇素 (selectins) 的交互作用使白血球產生tethering及滾動 (rolling)；(2)透過細胞激素活化 白血球細胞表面的整合素 (integrins)，改變整合素的構型以促進其與 ligands的黏附；(3)白血球spreading並藉由類免疫球蛋白
(Immunoglobin-like molecules) 與整合素的交互作用穩固地附著在內皮 上；(4)白血球由內皮層滲透至內皮層下，進而造成後續反應促使動脈粥 狀硬化的形成 (Lawson and Wolf, 2009)。
圖2.4 白血球徵募作用 (Lawson and Wolf, 2009)
2.1 黏著分子
在動脈粥狀硬化形成的過程中各種黏著分子分別參與了白血球的 tethering、滾動、黏附及滲透至血管壁內的過程 (Galkina and Ley, 2007)。以免疫組織化學 (immunohistochemistry) 染色影像證實在動脈 產生動脈粥狀硬化斑塊的區域有黏著分子的表現 (Kaufmann et al., 2007)。而依據 Gene Ontology Consortium 定義，細胞黏著分子為表現於 細胞表面之分子且調控與其他細胞或胞外基質的黏附作用，大致可分為 三類，包括選擇素、類免疫球蛋白分子及整合素 (表 2.1) (Blankenberg et al., 2003)。
表2.1 黏著分子及其配體 (Blankenberg et al., 2003)
2.1.1 選擇素 (selectins)
選擇素主要參與調控白血球在內皮層的tethering 與滾動，包
括L-selectin、P-selectin 及 E-selectin。選擇素與其配體 (ligand) 產 生交互作用，促使血流中的白血球降低流動速度以利後續黏附於 活化的內皮細胞之作用。
L-selectin 主要表現於白血球，在 L-selectin 缺陷之淋巴球研究 中證實L-selectin 表現減少時會降低 50%淋巴球在主動脈上的移行 作用 (Galkina et al., 2006)。P-selectin glycoprotein ligand (PSGL-1)
為L-selectin 的配體之ㄧ，廣泛的存在嗜中性球、單核球與淋巴球，
透過L-selectin 與 PSGL-1 的結合會促使血液循環當中的白血球與 在血管內皮上滾動的白血球產生交互作用，促進secondary capture
的發生。有研究指出L-selectin 調控白血球的徵募作用可能主要是
藉由L-selectin/PSGL-1 影響 secondary capture (Eriksson et al., 2001)。此外，PSGL-1 亦是 P-selectin 或 E-selictin 的配體，小鼠單 核球Ly-6Chi就是透過高度表現PSGL-1 而增加與 L-、P-及
抗體阻斷P-selectin 的作用或利用 siRNA 抑制 P-selectin 的表現皆 會顯著降低由乙醛所誘發的單核球THP-1 黏附作用 (Redmond et al., 2009)。
E-selectin 則只有表現於內皮細胞，在非發炎反應的情況下不
會表現，必須受到發炎細胞激素如IL-1 或 TNF-α 等的刺激才會誘 發其轉錄作用促進E-selectin 合成，而轉錄因子 NFκB 與此基因表 現有關 (Lin et al., 2007; Zakeri et al., 2000)。
2.1.2 類免疫球蛋白分子 (Immunoglobin-like molecules)
類免疫球蛋白分子superfamily 為表現於細胞膜上的醣蛋白，
而這些基因透過不同的剪接作用 (splicing) 產生多種 isoforms。
Intercellular adhesion molecules (ICAM) 屬於此 superfamily 中 的次家族，包括五個成員，ICAM-4 表現於 erythroid cells，ICAM-5 表現於大腦，與動脈粥狀硬化較無相關。ICAM-1 廣泛的表現於白 (Blankenberg et al., 2003)。
Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) 除了表現於內皮 細胞外，巨噬細胞、myoblasts 與 dendritic cells 亦會表現。在活化 的內皮細胞中，VCAM-1 藉由促使白血球牢固的黏附於內皮而參 與白血球的徵募 (Blankenberg et al., 2003)。VCAM-1 會與選擇素 α4β1 (又稱為 very late antigen 4，VLA-4) 作用，誘發內皮細胞的相 關訊息，促使其改變形狀以利白血球滲入血管壁下層。研究發現 當加入anti-VCAM-1-coated bead 或 anti-α4 integrin-coated beads 可
抑制淋巴球的移行作用，顯示淋巴球的移行需要VCAM-1 的黏附 作用 (Matheny et al., 2000)。
另外，platelet endothelial cellular adhesion molecule 1
(PECAM-1) 則表現於白血球、血小板及內皮細胞。在內皮細胞的 van der Saag, 1996)。ICAM-1 在白血球的徵募作用中透過與整合素 產生交互作用，停止白血球的滾動，將白血球穩固地黏附於內皮
層。許多研究包括利用抗體阻斷ICAM-1 的作用或藉由 ICAM-1
缺陷的模式證實ICAM-1 的黏附作用對於淋巴球穿透內皮層的移
行過程相當重要 (Lehmann et al., 2003; Reiss and Engelhardt, 1999)。除了內皮細胞與白血球外，許多細胞包括上皮細胞、平滑 肌細胞、纖維母細胞及角質細胞等皆會表現ICAM-1 (Roebuck and Finnegan, 1999)。ICAM-1 除了與動脈粥狀硬化有關外，它與其他 疾病亦有關，如：氣喘 (Cui et al., 2010)、局部缺血再灌流的損傷 (Cheng et al., 2008)、自體免疫疾病 (autoimmune disease)
(Yusuf-Makagiansar et al., 2002)等。
人類ICAM-1 基因位於第十九號染色體，包括七個 exons 與六
個introns (Voraberger et al., 1991)。在病毒感染、氧化壓力、LPS、
ox-LDL 或其他相關的促發炎細胞激素 (如：TNF-α、IL-1、IL-6、
IFN-γ 等) 刺激下會誘發 ICAM-1 表現。發炎介質透過調控 MAPK (Ying et al., 2009)、PKC (Min et al., 2005)、JAK/STAT (Audette et al., 2001)、Akt (Oh and Kwon, 2009)及 IKK/NF-κB (Lian et al., 2010) 等 訊息傳遞路徑來誘發ICAM-1 表現。參與調控 ICAM-1 表現的轉錄 因子包括AP-1 (Son et al., 2006)、STAT (Audette et al., 2001)、Sp1 (Berendji-Grun et al., 2001) 與 NF-κB (van de Stolpe and van der Saag, 1996; Zhou et al., 2007) 等。研究指出 ICAM-1 DNA 5’端的數 有研究指出藉由forskolin (adenylyl cyclase 活化劑) 增加胞內 cAMP 或利用 cAMP 相似物能夠抑制 TNF-α、IL-1β 或 IFN-γ 所誘 發的ICAM-1 蛋白質與 mRNA 表現 (Balyasnikova et al., 2000;
Panettieri et al., 1995)。
2.1.3 整合素 (integrins)
整合素為細胞表面的接受器，由18 種 α 與 8 種 β 次單元體所 組成的αβ 異質二聚體 (heterodimer) (Hynes, 2002)，調控著包括細 胞與細胞、細胞與胞外基質及細胞與病原體之間的接觸。整合素 表現於細胞表面，在未活化的細胞中整合素對配體的親合力低，
一旦受到刺激活化便會迅速改變其胞外domain 的構型，增加對配 體的親合力 (Blankenberg et al., 2003)。各種次單元中主要參與白 血球黏附作用的是β2與α4，LFA-1 (CD11a/CD18, αLβ2) 屬於整合 素的β2次家族 (subfamily)，在所有的白血球皆會表現，它能夠與 免疫球蛋白中的ICAMs 作用；VLA-4 (CD49d/CD29, α4β1) 則屬於
α4次家族，主要表現於單核球與淋巴球，會與VCAM-1 及
fibronectin 作用 (Galkina and Ley, 2007)。
2.2 細胞激素
活化的內皮細胞、白血球及淋巴球等會釋出許多參與發炎反應的細 胞激素，而這些細胞激素會經由其相對的接受器調控訊息傳遞路徑，進
而誘發黏著分子表現與促進白血球徵募作用。如表2.2 所列，許多細胞
激素 (包括 TNF-α、IL-1 及 IFN-γ 等) 會誘發細胞黏著分子 (cellular adhesion molecule, CAM) 表現 (Meager, 1999)。
表2.2 細胞激素誘發細胞黏著分子的表現 (Meager, 1999)
TNF-α
TNF-α 被認為與動脈粥狀硬化等心臟疾病有關，醣化終產物及
其接受器 (advanced glycation end-products, AGE/receptor for
AGEs，RAGE)、lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 (LOX-1) 及 NFκB 等訊息傳遞路徑對於 TNF-α 的表現扮演重要角色
IFN-γ、MCP-1、granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) 及 NF-κB (p65) 等 mRNA 表現皆高於 TNF-α-/-apoE-/-小 鼠，而TNF-α-/-apoE-/-小鼠的動脈脂肪條紋損傷面積亦明顯減少 (Xiao et al., 2009)。上述相關研究顯示 TNF-α 的表現對於動脈粥狀硬 化的形成扮演重要角色。
三、參與發炎反應之訊息傳遞路徑與轉錄因子 1. IκB kinase (IKK)/NF-κB
IKK/ NF-κB路徑參與調控許多生理作用包括免疫反應、細胞死亡與發 炎反應。NF-κB為一群轉錄因子的統稱，在哺乳動物細胞中NF-κB包含五 個家族成員，分別為RelA (p65)、RelB、c-Rel、p50/p105 (NF-κB1) 與 p52/p100 (NF-κB2)。這五個家族成員在N端domain上含有約300個胺基酸的 Rel-homology domain (RHD) 對於與抑制蛋白質 (inhibitor-κB，IκB) 及與 DNA序列的結合相當重要。RHD亦與NF-κB的五個家族成員互相形成同質 會遮蔽RHD上調控轉移作用 (translocation) 的nuclear localization sequence (NSL) 形成非活化態的複合物 (Moynagh, 2005; Perkins, 2007)。已知活化 NF-κB的路徑可分為canonical及non-canonical，當細胞受到前發炎細胞激素 (包括TNF-α、IL-1) 的刺激或暴露在細菌產物 (lipopolysaccharide, LPS) 下 會迅速活化canonical路徑，IKK複合物會快速的將IκBα的Ser32及Ser36磷酸 化，促進IκBα接上泛素 (ubiquitin) 並透過26S溶酶體 (proteosome) 降解 (Hayden and Ghosh, 2004)。IKK複合物包含了三個次單元IKKα、IKKβ及 IKKγ (NF-κB essential modulator，NEMO)。IKKα與IKKβ皆參與canonical 路徑，但研究指出在canonical路徑中IKKβ為主要的IκB kinase (Bonizzi and Karin, 2004)；IKKγ為不具激酶活性的調節次單元，對於IKKα/IKKβ的磷酸 化相當重要 (Rothwarf et al., 1998)。透過CD40、lymphotoxin-β 接受器或
TNF家族中的B-cell-activation factor等的刺激可活化non-canonical路徑。在 non-canonical路徑中最常見的為p52-RelB異質二聚體，它主要受到IKKα同 質二聚體的調控 (Bonizzi and Karin, 2004)。活化後的NF-κB能進入細胞核 結合至基因啟動子上的κB位置，並與其輔因子 (cofactor) 產生交互作用藉 以調控轉錄作用。NF-κB參與調控轉錄作用上還有其他調節者協助調控，
透過轉譯後磷酸化與乙醯基化 (acetylation) 修飾NF-κB的次單元對於其促 進基因轉錄具有加強作用 (Chen and Greene, 2004)。例如：p65次單元中的 絲胺酸可被磷酸化，而磷酸化的p65與其輔因子產生交互作用進一步被乙 醯基化後便具有最高的轉錄活性 (Chen and Greene, 2003)。其中，cAMP respose element binding protein (CREB) binding protein (CBP)/p300便具有 factor acetyltransferase (FAT) 的活性，可將轉錄因子乙醯基化 (Vo and Goodman, 2001)。有文獻指出干擾NF-κB與CBP之間的交互作用可明顯減 少與NF-κB相關之轉錄作用 (Parker et al., 1999)，例如：具有抗發炎作用的 tranilast便是透過減少血管內皮細胞中CBP的蛋白質表現而影響NF-κB相 關的轉錄作用，減少TNF-α誘發細胞表面ICAM-1、VCAM-1及E-selectin表 現量 (Spiecker et al., 2002)；另外，過度表現p65與CBP可加強轉殖到COS-7 細胞內E-selectin或VCAM-1啟動子的報導基因表現，但如果同時使12S E1A過度表現 (12S E1A本身會與CBP/p300結合) 則會減弱報導基因的表 現 (Gerritsen et al., 1997)。
IKK/NF-κB 與動脈粥狀硬化
NF-κB 參與調控免疫反應相關的蛋白質 (IL-2 receptor、tissue factor 及platelet-activating factor receptor 等)、黏著分子 (ELAM-1、VCAM-1 及ICAM-1 等)、細胞激素 (TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8 及 IL-12
等)、生長因子 (granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF) 和趨化細 胞激素等的基因表現，這些蛋白質產物與許多發炎反應之疾病有關，其
中包括動脈粥狀硬化。NF-κB 不僅會受到發炎細胞激素的刺激而活化，
活化後又會誘發這些細胞激素的表現，因此更加強了NF-κB 的活化作
用 (Sun and Andersson, 2002)。研究指出當給與大鼠高脂飲食會明顯增
加其內皮細胞及動脈平滑肌細胞NF-κB 的活化並造成動脈粥狀硬化的
2. cAMP/protein kinase A (PKA)/CREB
生物體因應個體需求或環境因素會刺激荷爾蒙等物質的分泌，而這些 物質必須由細胞膜表面的接受器辨認後，利用二級訊息傳遞分子以進行一 連串的訊息傳遞作用。當細胞膜表面的G protein-coupled receptor 受到刺激 活化後會進一步去活化adenylyl cyclase (AC)，造成 ATP 水解產生 cAMP。
cAMP 在細胞中為重要的二級訊息傳遞分子，而 cAMP-dependent protein kinase (PKA) 的活化被認為與增加胞內 cAMP 濃度有關。PKA 為異質四聚
體的酵素複合物，由兩個催化次單元與兩個調控次單元所組成，調控次單
轉錄因子cAMP-responsive element-binding protein (CREB) 的磷酸化 與PKA 的活化有關。CREB 包含一個 kinase-inducible activation domain (KID)，而其蛋白質上的 Ser133 可被 PKA 磷酸化。當 CREB 磷酸化後會結 合至基因啟動子上的cAMP responsive elements (CREs) 並與輔因子
CBP/p300 產生交互作用藉以調控下游基因表現 (Michael et al., 2000; Ziff, (Ollivier et al., 1996; Parry and Mackman, 1997)。在將報導基因轉殖到 HUVECs 的研究中發現過度表現 CBP 可明顯降低 forskolin 對 NF-κB 轉 錄作用的抑制效果，而過度表現CREB 則可加強 forskolin 抑制 NF-κB 所調控的轉錄作用 (Parry and Mackman, 1997)。在 Jurkat T-lymphocytes 中無論是直接處理PKA 活化劑 (forskolin、dibutyryl cAMP 與
8-bromo-cAMP) 或藉由過度表現 PKA 的催化次單元皆能抑制 NF-κB
8-bromo-cAMP) 或藉由過度表現 PKA 的催化次單元皆能抑制 NF-κB