研究方法
(一) 雷公藤組織培養藥材部份 1. 癒傷組織之培養 3, 4
本研究之雷公藤培植體為以培養好之癒傷組織，亦可取雷公藤植株之莖尖，
嫩葉與嫩莖開始培養。在培養 1 個月後選擇適當癒傷組織繼續繼代培養，將癒傷組 織量增加以利實驗進行。
2. 抗氧化作用
將 培 養 之 癒 傷 組 織 以 水 及 有 機 溶 劑 ( 如 乙 醇 ) 萃 取 後 ， 依 清 除α， α-diphenyl-β-picrylhydrazyl（DPPH）自由基能力之測定方法測定，其原理如下：
清除α，α-diphenyl-β-picrylhydrazyl（DPPH）自由基能力之測定：
油脂在自氧化的過程中會產生自由基而造成油脂酸敗，常見的抗氧化物藉由 提供氫(hydrogen doner)來清除脂質過氧化物自由基(peroxyl radical)進而達到抑 制氧化鏈鎖反應之進行，在抗氧化的研究上通常使用 DPPH 來評估抗氧化的供氫能 力。DPPH 之甲醇或乙醇溶液在 517 nm 下會有強吸光，但是被抗氧化劑(AH)還原時 則吸光值降低，因此在 517 nm 的吸光值愈低即表示抗氧化劑的供氫能力愈強。樣品 若有顏色干擾情形，則可採用 HPLC 方法分析。
(二) 以中草藥抽取物加入米麴菌發酵為研究的題材上。我們選用二十種中草 藥，將其中的成分經過甲醇萃取，濃縮，乾燥之後之粉末，分別加入米麴菌發酵培 養液中進行發酵作用。發酵完成之培養液再經甲醇萃取，濃縮，乾燥之後得到發酵
後之粉末。接著我們測試發酵前粉末與發酵後粉末，其中抑制酪胺酸酶活性分析之 比較實驗。
本研究計畫之工作項目可細分為下列四點，其實驗步驟詳述如下:
1 中藥發酵前及發酵後成分之萃取 1. 中藥材購自藥行。
2. 將購得之中藥磨成粉後以乙醇浸泡數次，將萃取液以減壓濃縮機濃縮。
3. 將抽提物用不同極性之溶媒分配萃取（正己烷、乙酸乙酯、水），所得之乙酸 乙酯抽取液減壓濃縮後得到中藥萃取物，並進行抑制酪氨酸酶之活性分析之 藥理試驗以及添加入米麴菌發酵液中進行發酵試驗。
2 菌株孢子採集
1. 將購買自菌種保存中心的菌株冷凍乾燥管於無菌操作台中利用冷熱破碎法將 之打破。
2. 將乾燥的保存菌體經無菌水潤濕後，加入預先配置好的 PM 固態培養基(麥芽 糖萃取物 20 g/L, 葡萄糖 20 g/L, 蛋白胴 1 g/L, 洋菜 20 g/L,並調 pH＝7.0)，並 利用無菌玻璃塗抹棒均勻塗抹。
3. 將接種完成的固態培養基置於室溫中培養一週，等待其中菌絲體生產孢子。
4. 菌種培養完成後，在無菌操作台上，將直徑約 0.2mm 之玻璃珠約 30 顆倒入 已佈滿孢子的培養皿中。
5. 將培養皿劇烈左右搖晃至小玻璃珠上沾滿孢子。
6. 用滅過菌之刮杓將玻璃珠刮至 50ml 離心管中。離心管已裝了含 0.1%
Tween-80 清潔劑的無菌水 30ml 並且滅過菌。
7. 將離心管的蓋子鎖緊後拿出無菌操作台，放至超音波震盪箱中震盪 10 分鐘。
8. 於無菌操作台中利用無菌 30％甘油水將離心管內的孢子液置於-20℃冰箱保 存，作為本研究所使用的菌株孢子保存液來源。
3 菌株發酵培養
1. 將欲培養之菌株的孢子保存液自-20℃冰箱自中取出並置於 30℃水浴槽使其 回溫。
2. 將回溫的孢子保存液接種進入含有 50ml PM 培養基(接種濃度為 105
spore/ml，培養基成分：麥芽糖萃取物 20 g/L, 葡萄糖 20 g/L, 蛋白胴 1 g/L, 並 調 pH＝7.0)，的 250ml 平底三角錐瓶中。其中培養液含有濃度 1mg/ml 的中草 藥萃取粉末。
3. 將接種完成的培養基置於 30℃恆溫震盪培養箱，於轉速 120rpm 下進行培養。
4 發酵液萃取
1. 將 50ml 甲醇加入發酵液（50ml）樣品中，在 40℃中震盪四小時。
2. 萃取完成後，利用減壓過濾法去除固態物質。
3. 將萃取溶液進行減壓濃縮。
4. 再將濃縮物進行抑制酪氨酸酶之活性分析之藥理試驗並進行管柱液相層析進 一步純化分離其中有效成分。