3-1 實驗藥品與儀器
3-1-1 實驗材料與藥品
(1) Photo resist ZEP520A
，購自 ZEONREX electronic chemicals (2) Developer N-pentyl acetate(ZED-N50)
CH3CO2(CH2)4CH3，MW:130.19，99%，購自 Alfa Aesar (3) Remover Dimethylacetamide(ZDMAC)
CH3CON(CH3)2，MW:87.12，購自 ZEONREX electronic chemicals (4) Acetone
(CH3)2CO，MW:58.08，購自 TAIWAN MAXWAVE Co., Ltd.
(5) Isopropanol(IPA)
(CH3)2CHOH，MW:60.10，購自 TAIWAN MAXWAVE Co., Ltd.
(6) Nanodiamond
Size:0-0.25μm，購自 BAOO WEI International Co., Ltd.
(7) Sulfuric Acid
H2SO4，MW:98.08，購自 TAIWAN MAXWAVE Co., Ltd.
(8) Nitric Acid
HNO3，MW:63.012，購自 TAIWAN MAXWAVE Co., Ltd.
(9) (3-Aminopropyl)triethoxysilane(APTES)
H2N(CH2)3Si(OCH2CH3)3，MW:221.37，98%，購自 Alfa Aesar
(10) Ethanol
CH3CH2OH，MW:46.07，95%，購自 UNI-WARD Corp.
(11) 2-(4-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate(MES) C6H13NO4S‧H2O，MW:213.26，98%，購自 Alfa Aesar
(12) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC) CH3CH2N=C=N(CH2)3N(CH3)2‧HCl，MW:191.71，98+%，購自 Alfa Aesar (13) N-hydroxy succinimide(NHS)
C4H5NO3，MW:115.09，98+%，購自 Alfa Aesar (14) Poly-L-lysine hydrobromide(PLL)
，MW:15,000-30,000，購自 Sigma-Aldrich (15) Fluorescein isothiocyanate(FITC)
，MW:389.38，購自 Thermo SCIENTIFIC (16) Borate buffer，pH:8.5
購自Thermo SCIENTIFIC
(17) Dimethyl sulfoxide(DMSO)
(CH3)2SO，MW:78.13，購自 Thermo SCIENTIFIC
(18) 1mM Gold nanoparticles
Size:15-20nm，交通大學應用化學所李耀坤老師實驗室提供 (19) Sodium chloride
NaCl，MW:58.443，交通大學應用化學所余艇老師實驗室提供
(20) DNA sequence : 5'- H2N-GGAATTCCATATGGAATTCC 購自Bio basic Inc.
(21) DNA sequence :5'-HS-GGAATTCCATATGGAATTCC 購自Bio basic Inc.
(22) Phosphate buffered saline(PBS)，pH:7.4 購自Bio basic Inc.
(23) Restriction enzyme NdeI
交通大學應用化學所李耀坤老師實驗室提供
(4)電子束微影系統( Electron Beam Lithography System，ELS-7500EX，
ELIONIX Inc. )，交通大學奈米科技中心，進行微影製程以及掃描式電子顯
微鏡觀測。
(5)共軛焦顯微鏡( Confocal microscopy，LabRAM HR800，HORIBA JOBIN YVON )，交通大學奈米科技中心，進行實驗樣品的拉曼以及光激發螢光 光譜量測。
(6)酸鹼度計( pH meter，Microprocessor pH meter SP-2200，其電極是使用 Mettler Toledo InLab422，SUNTEX INSTRUMENTS Co., Ltd. )，交通大學 應用化學所余艇實驗室，進行反應酸鹼值量測。
3-2 奈米鑽石的定位化晶片
3-2-1 奈米鑽石酸化步驟
奈米鑽石經過強氧化酸酸洗的步驟，可以把表面sp２結構去除，並讓 鑽石表面產生羧基-COOH，可以應用到與含有胺基-NH2的生物分子鍵 結。酸化的步驟則是參考實驗室王鏡堯學長的方式[26]，如圖3-1所示。
圖 3-1 奈米鑽石酸化步驟
3-2-2 電子束微影製程定義圖形
裝適量的丙酮(Acetone)、異丙醇(Isopropanol ,IPA)以及去離子水(DI water)，先把晶片置於丙酮中配合超音波震盪機震盪五分鐘，初步去除表面的微 粒，接著再把晶片置於異丙醇中配合超音波震盪機震盪五分鐘，異丙醇會 把晶片上殘留的丙酮有機溶劑帶走，最後再把晶片置於去離子水中超音波 震盪五分鐘，去離子水會把殘留的異丙醇溶劑帶走，最後用氮氣槍吹乾完 成清潔的步驟。
二.實驗上所選用的電子阻劑是ZEONREX electronic chemicals所製造的 ZEP520A，將清洗好的晶片利用旋轉塗佈的方式，配合適當的轉速得到厚 度約300nm的阻劑層，接著晶片要經過180℃烘烤三分鐘，把光阻中溶劑烤 乾，等待晶片冷卻後即可進行下一步驟。
三.使用的Wecas繪圖程式設計圖形，設計的圖形如圖3-4所示，整個矽 基板破片，包含四個Cross mark和二十個定義圖形：兩個Cross mark之間間 隔6mm，每一個Cross mark長為600μm，寬為25μm，設計Cross mark的目 的，是為了在顯影後能夠用肉眼觀察到定義圖形的所在位置，而我設計的
用異丙醇以及去離子水沖洗，用氮氣吹乾即完成陣列晶片的製作。
圖 3-2 二氧化矽層厚度與晶圓顏色對應圖[27]
圖 3-3 基板製作流程圖
圖 3-4 定義圖形設計簡圖
3-2-3 自組裝單層膜與奈米鑽石之定位化
1%、2%、3%、10%的 APTES 試劑等參數，其中由於不同的溶劑對光阻破 壞性皆不一樣，經過測試我最後選擇的是ZEP520A 搭配乙醇來配置 2%的接著，使用EDC/NHS 試劑[28]活化奈米鑽石表面的羧基，讓羧基容易 配置的試劑濃度分別是0.1mM MES buffer、0.025M EDC、0.025M NHS、
0.1g 的奈米鑽石分散於 100ml 去離子水，取用適量的比例( MES buffer : ND : DI water : E
水
◎在陣列的奈米鑽石上標定FITC 染料
下一步反應試劑的配置：取 8mg PLL 溶於 20ml Borate buffer，並取 10mg FITC 溶於 1ml DMSO，實驗的步驟是把基板浸入 3ml Borate buffer 後，加 入1ml PLL 溶液反應三十分鐘，完成後使用 Borate buffer 與去離子水沖洗 並且進行去光阻步驟。接著，再把基板浸入2ml Borate buffer 後，加入 0.02ml FITC 溶液在暗室下反應一小時，完成後使用 DMSO 沖洗去除多餘染料，即 完成陣列晶片的製作，實驗流程圖如圖 3-7
驗
C
Stable amide bond
圖 3-6 形成醯胺鍵的反應機構
圖 3-7 奈米鑽石上胺基化和染料標定的流程圖[29]
3-2-4 結構與光譜量測
在實驗樣品的結構量測部分，我使用電子束微影系統的 SEM 功能，來 觀察基板上奈米鑽石的反應鍵結情形。
在實驗樣品的光譜量測部分，我使用共軛焦顯微鏡的光學顯微功能，
先用10 倍以及 100 倍的物鏡找到基板上圓點陣列的位置，並且利用電腦的 影像擷取系統記錄下來，接著使用波長為488nm 和 633nm 的固態雷射聚焦 在奈米鑽石陣列點上面，量測拉曼以及PL 光譜。進一步再利用共軛焦顯微 鏡的Mapping 功能，得到空間對訊號強度的拉曼以及 PL 光譜。
3-3 奈米鑽石耦合奈米金的量測平台
3-3-1 奈米鑽石耦合奈米金樣品的製作
◎電子束微影製程定義圖形
實驗樣品的製作與前一部分的實驗步驟相同，我會先在矽晶圓上成長 約400nm 厚的二氧化矽層，並且會將其裁切成 0.75cm ╳ 0.75cm 大小的正 方形破片，接著才進行微影步驟。
在微影製程步驟，基板要先經過清潔、塗光阻、設計定義圖形、微影 以及顯影等，其中設計的圖形，如圖3-8所示，為9 ╳ 9的100μm的方形陣 列，而在方形陣列中，方塊與方塊距離為100μm。
圖 3-8 定義圖形設計簡圖
◎自組裝單層膜與奈米鑽石之定位化
在自組裝單層膜的製程，如前述步驟把基板置入2 vol% 的 APTES 溶
液中反應。 度分別是0.05M PBS buffer、0.025M EDC、0.025M NHS、0.1g 的奈米鑽石 分散於100ml 去離子水，取用適量的比例( PBS buffer : ND : EDC : NHS = 3ml : 2ml : 1ml : 1ml )反應一小時後用去離子水沖洗，接著使用去光阻劑 ZDMAC 去除光阻。
◎DNA 雜合反應耦合奈米金粒子
下一步反應為奈米金的耦合，反應試劑的配置：取100μM 已修飾上胺 基的DNA 序列 5'- H2N-GGAATTCCATATGGAATTCC(以下篇章，簡稱為 DNA1)，配置成 10μM DNA1 溶液；取 10μl 的 100μM 已修飾上硫醇基 的DNA 序列 5'-HS-GGAATTCCATATGGAATTCC(以下篇章，簡稱為 DNA2) 和10μl 的 Gold nanoparticles 反應十二小時，再加入 40μl 的 0.01M PBS buffer 四小時，再加入 20μl 的 0.05M NaCl 溶液四小時，再加入一次 20μl 的0.05M NaCl 溶液，配置成 10μM DNA2 溶液，所配置的 DNA 溶液在使
用前皆保存在4℃的環境下。 buffer 和去離子水仔細沖洗，把未鍵結的 DNA2-Gold NPs 沖掉，並且用氮 氣槍吹乾，即完成實驗樣品的製作。
水，滴在實驗樣品上，在37℃的環境下反應 2 小時，最後用去離子水仔細 沖洗。
圖 3-9 限制脢 NdeI 的作用部位圖示
3-3-2 結構與光譜量測
在實驗樣品的結構量測部分，我使用電子束微影系統的SEM 功能，來 觀察基板上奈米鑽石的反應鍵結情形。
在實驗樣品的光譜量測部分，我使用共軛焦顯微鏡的光學顯微功能，
先用10 倍以及 40 倍的物鏡找到基板上方形陣列的位置，並且利用電腦的 影像擷取系統記錄下來，接著使用波長為488nm 的固態雷射聚焦在奈米鑽 石陣列點上面，量測拉曼以及PL 光譜。
由於我想去量測的是奈米金經由 DNA 雜合反應後，接上奈米鑽石的表
面，所造成的光學訊號改變。所以我在奈米鑽石陣列晶片完成後，就要先 量測PL 光譜；奈米金粒子反應上晶片後，再量測 PL 光譜觀察訊號變化；
等到限制脢把雙股DNA 切斷並把金粒子去除後，再量測 PL 光譜來觀察奈 米鑽石-奈米金之間的交互作用。
3-4 參考資料
[26]王鏡堯 論文: Optical properties of single nano-diamond particle，國立東華大學應 用物理研究所
[27] http://www.htelabs.com/appnotes/sio2_color_chart_thermal_silicon_dioxide.htm SiO2 Color Chart for thermally grown silicon dioxide
[28]Alexey Shavel, Nikolai Gaponik, and Alexander EychmullerCovalent Linking of CdTe Nanocrystals to Amino-Functionalized Surfaces ChemPhysChem 2005, 6, 449 –451
[29] L.-C. Lora Huang and Huan-Cheng Chang Adsorption and Immobilization of Cytochrome c on Nanodiamonds Langmuir 2004, 20, 5879-5884