本實驗分為四個部份，第一個部份為奈米微粒製備，並對製備出的奈米微粒 進行分析；第二部分為不同構形奈米高分子與軟骨細胞共培養，將纖維構形(溶 液的形式)及奈米微粒分別與軟骨細胞共培養，探討其對於軟骨細胞分泌細胞外 基質生理功能性表現；第三個部份為不同奈米構形分子對軟骨細胞之調控機制 與途徑，探討加入阻斷前及阻斷劑後軟骨細胞外基質生成之途徑探討；第四部 份動物實驗，驗證其對於大白兔膝關節軟骨修復作評估，其實驗架構如(圖 3-1)。
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圖 3-1 實驗架構
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3-1 第二型膠原蛋白的萃取與鑑定
本研究所採用之第二型膠原蛋白，由實驗室自行提煉萃取，來源為牛膝關節 軟骨純化而成，其萃取純化過程需全程維持 0℃~ 4℃之環境溫度，以確保膠原 蛋白之穩定，避免其變性。
3-1-1 第二型膠原蛋白的萃取
收集大量新鮮牛膝關節，於低溫下將牛膝關節表面之軟骨切丁取下，以磷酸 緩衝溶液沖洗數次後，保存於磷酸緩衝溶液當中。使用濾網將軟骨瀝乾以除去 磷酸緩衝溶液，軟骨以1：15 的比例混入GuCl solution（4M；pH 7.4）48小時，
在這期間不定時以均質機攪拌以溶出Glycosaminoglycan。48小時反應完成後，
以二次水清洗軟骨數次，將軟骨浸泡於軟骨體積2倍之acetic acid solution（0.5N）
當中，並加入0.05mg/ml pepsin 反應24小時，將第二型膠原蛋白自軟骨中溶出。
第二型膠原蛋白溶出後以超高速冷凍離心機離心（4℃；12000rpm；60分鐘），
取上清液加入sodium chloride（NaCl；0.86M）24小時，並不定時以均質機攪拌 以將第二型膠原白析出。最後將鹽析後之醋酸溶液再次離心（4℃；12000rpm；
60 分鐘），將其沉澱物以0.5M NaCl、0.05M Tris-base 溶液溶解，再依序使用 0.5M NaCl-0.05M Tris-base、0.2M NaCl-0.05M Tris-base 以及磷酸緩衝溶液進行 透析後，於4℃下以42500rpm 之轉速離心，取溶液上三分之二保存即可。
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3-1-2 第二型膠原蛋白濃度測定
本實驗中對於蛋白質的濃度測定所使用的是lowry法，此測試方法不會因為 蛋白質種類的不同而影響。Lowry法其原理為利用鹼性溶液中的銅離子會與蛋白 質peptide bond 上的carbonyl 結合形成紫色複合物的特性，再將Folin-ciocalteu 與之混合使Folin-ciocalteu 所含phosphomolybdic-phosphotungstate與紫色複合物 作用產生藍色物質，量測此藍色物質之吸光値即可推得蛋白質濃度。此測定須 先調配三種混合詴劑：A 劑內含0.4％ Potassiumsodium tartrate、10％ Sodium carbonate（Na2CO3）以及0.5N Sodium hydroxide（NaOH）；B 劑內含2％ Potassium sodium tartrate、3％ Copper sulfate pentahydrate（CuSO4‧5H2O）以及0.1N Sodium hydroxide（NaOH）；C劑則是以二次水將Folin-ciocalteu 以1:15 比例稀釋即可。
濃 度 測 定 前 須 先 將 標 準 液 以 及 未 知 濃 度 膠 原 蛋 白 溶 液 以 0.5N acetic acid
（CH3COOH）稀釋成多種比例以利標準曲線之製備以及濃度之推算。測定方式 先將200μl 膠原蛋白 sample、180μl A 劑以及20μl B 劑均勻混合後於50℃水浴 20 分鐘，待其降溫後各加入600μl C 劑並再次以50℃水浴10 分鐘，最後使用 ELISA 測其於650nm 之吸光值並完成濃度之推算。
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3-2 天然高分子奈米粒子製備
本研究擬以平行電場系統，藉由各項製備條件及參數之設定，製備出之天然 高分子奈米微粒(第二型膠原蛋白、透明質酸與硫酸軟骨素)。
3-2-1 電場設備架設
此系統包括:高壓直流電於供應器、波行產生器、控溫罩、雙層平行電極板(圖 3-2)，其利用波行產生器控制輸出電壓之波形，另外將電源供應器之正負極分別 接於平行電板之上下端，以控溫罩控制奈米粒子製成溫度。
3-2-2 電場控制參數及製備流程
方法簡述如下：將天然高分子溶液各取 1 mL 加入塑膠皿中，將其放入規格 為 18 cm × 6 cm × 2 cm 之電場夾板，分別於特定溫度下以不同電場強度反應不 同時間，不同天然高分子帶有不同的電性與性質，因此於製備參數上將依各個 天然高分子分別進行製程探討，須進行探討的參數如下：
(1) 平行電場電壓、頻率的參數影響 (2) 平行電極板之間的距離
(3) 平行電場製備的反應時間 (4) 系統溫度的影響
(5) 天然高分子溶液濃度跟體積
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圖 3-2 平行電場製備奈米微粒流程圖 3-2-3 FITC-HA 奈米微粒製備
為探討不同構形天然高分子與軟骨細胞的結合方式，因此將異硫氰酸螢光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC)接枝於透明質酸上，以平行電場製備出帶有 FITC標定之螢光奈米微粒。其實驗步驟簡述如下:
將 HA 粉末(0.2mg/ml，泡 10ml)溶於二次水中攪拌一天，加入 FITC 粉末 (0.2mg/ml)混合攪拌均勻(避光)。將所得混合液放入透析袋，以二次水透析除去 未反應物(透析約三天在 4℃下避光)。將透析完的產物，抽冷乾(約兩天)，及其 抽乾之產物滅菌後溶於無菌二次水中，取 1ml 的溶液，放到 dish 中，以平行電 場製備出帶有 FITC 標定之螢光奈米微粒。
Nanoparticles
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3-2-4 天然高分子奈米粒子之觀察
穿透式電子顯微鏡(Transmission electron microscopy, TEM) 現今少數可以觀 察奈米尺度的儀器之ㄧ，基本上與光學顯微鏡非常相似，利用電子束取代了可 見光作為照明燈源，是利用高能電子束（約在100keV~1MeV）穿透厚度低於 100nm 以下之薄樣品，和薄樣品內的各種組織產生不同程度之散射，散射後的 電子以不同的行徑通過後續的透鏡組合和透鏡光圈，形成明暗對比的影像，而 這些明暗對比之微結構影像是藉由螢光板來呈現。
本實驗所製備之天然高分子奈米微粒，需藉由穿透式電子顯微鏡的原理來觀 察奈米微粒的型態，以評估其奈米微粒分子大小及尺寸分布，穿透式電子顯微 樣本主要是利用負染色的方式將天然高分子奈米微粒於 TEM 鍍碳銅網上顯現 以證實其存在。將含有天然高分子奈米微之溶液滴於覆有forma膜的TEM 銅網 上，並以過濾後之2％磷鎢酸 (Tungstophosphoric acid hydrate) 進行負染色，負 染後之樣本於無菌操作台中風乾，接著利用穿透式電子顯微鏡(Philip CM-200) 觀察，期望能透過改變奈米構形生物分子尺寸製備參數，製備出符合生物分子 與細胞膜上受體結合之最佳化奈米構形分子。
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3-3 軟骨細胞之萃取與培養
準備數隻 4 週之紐西蘭大白兔幼兔，以過飽和之 KCl 溶液於心臟注射犧牲 後，利用手術刀於膝關節處表皮劃開，接著依序將膜組織、肌肉、內外側副韌 帶與前後十字韌帶切除分離後將股骨端取下，取下之股骨浸泡於磷酸鹽緩衝溶 液中並於無菌操作台進行下一步驟。將軟骨切丁取下前，須將軟骨表面殘留之 膜與韌帶進一步刮除乾淨，並且以無菌之磷酸鹽緩衝溶液清洗數次，清洗後之 軟骨以手術刀將其切丁削下，隨後將軟骨碎片浸泡於protease (2 mg/ml)反應 2 小 時將 proteoglycans 溶解，接著改浸入 2 mg/ml Collagenase type II /無血清培養液 (F-12)之溶液反應。由於 Collagenase type II 可將膠原蛋白纖維分解，此時軟骨 細胞會隨著膠原纖維之分解被釋放於溶液中，將此 Collagenase solution 以 1500 rpm 離心 10 分鐘後移除上澄清液，以 F-12 培養液將沉澱物混合均勻後分注至 75T flask 培養，軟骨細胞每天以磷酸緩衝溶液清洗數次後更換新的 F-12 培養液 10%胎牛血清，200 U/ml 抗生素(penicillin/streptomycin)，待細胞培養至第二代 後立即進行細胞實驗。
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3-4 軟骨細胞與奈米生物分子結合方式之分析
探討不同構形天然高分子與軟骨細胞的結合方式，因此以 FITC-透明質酸奈 米微粒及 FITC-透明質酸纖維構形，與軟骨細胞共培養，透過藉由帶有螢光標記 之不同構形分子與軟骨細胞之作用觀察到材料與細胞之結合方式。
3-4-1 FITC-透明質酸奈米微粒/纖維構形與軟骨細胞共培養
將製備好之奈米微粒/纖維構形與軟骨細胞培養，透過帶有 FITC 標定之螢 光材料與細胞作用，觀察不同時間點奈米微粒/纖維構形於軟骨細胞之交互作 用，透過此方式可以了解到不同構形之分子與軟骨細胞作用之結合方式，其 實驗步驟簡述如下:
將第二代軟骨細胞以 trypsin 切下，軟骨細胞密度 5x104cell/ml，奈米微粒/
纖維構形濃度 10-2mg/ml，將製備好之奈米微粒粒/纖維構形各別與軟骨細胞混合 懸浮共培養 3 小時於 50ml 離管中，3 小時後，將細胞和奈米微粒/纖維構形混合 溶液各別加入在玻片上。依據時間點 3、6、9、12、24hr 收點，再以磷酸緩衝溶 液清洗三次，將細胞樣本以 4 %甲醛(formaldehyde) 固定 20 分鐘，用磷酸緩衝 溶液沖洗數次，以 DAPI 作用 5 分鐘，進行染細胞核，再以磷酸緩衝溶液清洗三 次，每次 5 分鐘，最後將其樣本封片，並使用雷射掃描式共軛焦顯微鏡觀察之。
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3-4-2 軟骨細胞與奈米生物分子結合方式之分析
以雷射掃描式共軛焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscope)觀察將樣 品以磷酸緩衝溶液清洗三次，將細胞樣本以 4 %甲醛(formaldehyde) 固定 20 分 鐘，用磷酸緩衝溶液沖洗數次，接著以 0.5 % Triton X-100 滲透細胞膜作用 20 分鐘，並再次以磷酸緩衝溶液清洗數次後，以 DAPI 作用 5 分鐘，進行染細胞核，
再以磷酸緩衝溶液清洗三次，每次 5 分鐘，最後將其樣本封片，並使用雷射掃 描式共軛焦顯微鏡觀察之。
3-5 軟骨細胞與不同天然構形高分子 3D 共培養
本實驗將單一條件之奈米構形分子與含有固定軟骨細胞數之細胞培養液混 合，期望透過奈米構形分子與軟骨細胞之結合，進而影響軟骨細胞之生理功能 與行為，比較加入阻斷劑，阻斷細胞訊息傳遞受器後，不同構形之分子對於軟 骨細胞外基質影響，為探討奈米構形分子對於軟骨細胞外基質之影響，其研究 軟骨細胞分泌外基質之影響途徑。
利用攪拌式懸浮培養軟骨細胞的方式，探討添加不同奈米構形高分子，對於 軟骨細胞外基質之影響。本實驗將三種不同高分子、兩種不同奈米構形，分別 與軟骨細胞於3D共培養，藉以探討所製備出材料對軟骨細胞的影響，實驗條件 如(表3-1):
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表 3-1 軟骨細胞與不同奈米構形高分子於 3D 培養之條件
3-5-1 軟骨細胞添加不同構形天然高分子
本實驗將軟骨細胞分別加入纖維構形及奈米微粒於 37℃ incubator 內培養 三小時，待三小時後將此混合溶液注入至 3D 攪拌生物反應器內，最後將生物反
本實驗將軟骨細胞分別加入纖維構形及奈米微粒於 37℃ incubator 內培養 三小時，待三小時後將此混合溶液注入至 3D 攪拌生物反應器內，最後將生物反