第三章 研究方法 第一節、實驗設計(Fig. 5)
一、 研究目的(一)：探討 OPN 於精液中之表現情形
實驗設計：利用西方墨點法(Western blot)分析精液中 OPN 蛋白之表現 情形。
二、 研究目的(二)：分析 OPN 於精子中之表現情形。
實驗設計：
1. 利用西方墨點法(Western blot)分析精子中 OPN 蛋白之表現量。
2. 分別探討各等級游動力之精子其 OPN 之表現情形。
3. 利用免疫螢光分析法，觀察 OPN 於精子中表現之位置。
三、 研究目的(三)：觀察添加 OPN 後，對於精子游動力之影響
實驗設計：利用電腦輔助精子分析儀(CASA)分析加入 0.1μM OPN 後 對於各等級游動力之精子游動力及各項運動參數之影響。
四、 研究目的(四)：探討 OPN 對於精子受孕能力之影響 實驗設計：評估精子受孕能力試驗
1. 精子移動至卵子之能力測定(In vitro migration patterns assay) 2. 精子穿透卵子試驗(Sperm penetration assay；SPA)
3. 精子之頂體反應(Acrosome reaction assay) 4. 體外受精試驗(In vitro fertilization assay)
五、 研究目的(五)：探討 OPN 提高精子受孕能力之機制
實驗設計： 精子細胞骨架蛋白(cytoskeleton)之免疫螢光染色，包括 actin、 spectrin 與 α-tubulin。
第二節、實驗方法與材料 一、 精液收集
本研究之男性精子來源為醫學中心門診病人，檢體依照游動力 Grade3 與 Grade4 總和所佔之比率，將檢體區分為低(0-30%)、中 (31-60%)、高游動力之精子。Grade3 與 Grade4 之精子佔全部之 30%
以下列為低游動力組，稱為Group 1；介於 31-60%則為中游動力組，
稱為Group 2；而高於 60%則屬游動力佳之高游動力組，稱為 Group 3(Table.2)。
二、 精液分析檢查
收集禁慾 3-5 天之新鮮精液，靜置 20 分鐘後，待其完全液化。
取 5 μl 之精液置於 Makler chamber 上，並在 37℃之加熱平台，以輔 助 精 子 分 析 儀 (CASA；IVOS 10.7s, Hamilton Thorne Research, Beverly, MA)。影像之擷取於 20 倍顯微鏡下，隨機抽選四個視野下 做分析；CASA 之分析於每一個視野下連續擷取 64 張影像，並且至 少分析 100 之精子。
CASA 對精子運動參數進行分析。包括精子游動力與各項運動 參數，如曲線速度 VCL(μm/sec)、直線速率 VSL(μm/sec)、平均路 徑速率 VAP(μm/sec)、直線前進 LIN(%)、前向性 STR(%)、頭部擺
動振幅 ALH(μm)、搏動頻率 BCF(%)以及擺動性 WOB(%)。其中 VSL、VAP 代表精子前進指標，而 VCL 則代表精子活力指標。
三、 西方墨點法(Western Blot)分析 OPN 蛋白表現量
收集病人之精液，分析其精子濃度與游動力，包括Grade 3、Grade 4 與progressive motility 所佔的比率。並將精子以 600 x g，10 min 離 心分離。並將收集到的精子以PBS 清洗 2 次。利用 Western blot 分 析各檢體中精液與精子中所含之OPN 量。
Western blot 利用 SDS-PAGE 於室溫中將蛋白分離，利用 Milliblot semi-dry transfer system (Millipore, Bedford, MA) 於 25 V 下 30 分鐘轉漬至 nitrocellulose paper (Trans-Blot Transfer Medium;
Bio-Rad)上。再利用 Ponceau S (0.5% Ponceau S, 1% acetic acid)染色 後以PBS solution containing 0.1% Tween 20 及 5% BSA 於 4°C 隔 夜。隔日加入 primary antibody (以 1:1000 的 PBS 稀釋，加入 0.1%
Tween 20 及 1% BSA) 於 PBS-Tween 20 含 1%羊血清中(goat serum)清洗 30 分鐘。之後加入 peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:10000 以 PBS 稀釋，含 0.1% Tween 20，1% BSA)作用 2 小 時, 於 PBS-0.1% Tween 20 清洗三次，每次 15 分鐘； 最後置於 PBS 中5 分鐘。 並且另外一組以 rabbit preimmune serum 加入 primary
antibody 作為 negative control 。Blots 於 1:1 dilution 稀釋的 ECL 試劑中反應，纖維膜於 Fuji medical x-ray film (Fuji, Tokyo, Japan) 中曝光 3~15 秒。底片利用 Bio-Rad densitometer scanner (Model GS-670)(Bio-Rad,City,State) 顯 像 ， 並 利 用 manufacturer's recommendations (Molecular Analyst; Bio-Rad Image Analysis Software,City,State)分析結果。
四、 以OPN 處理精子觀察對精子的受孕能力的影響 1. 精子穿透力試驗(Sperm penetration assay；SPA)
精子液化後，於實驗組加入含 0.1μM 之 OPN，室溫中培養 30 分鐘後以 Human tubal fluid (HTF, Irvine Scientific, Santa Ana, CA)(Table.3)調至 1×106/ml 的濃度準備與 Hamster 的卵子進行穿 透力試驗(Fig. 6)。Hamster 的卵子利用 0.5% pronase (Sigma, St.
Louis, MO) 除去透明帶， 並置於含 0.2ml 之處理後的精子作用 3-3.5 小時後觀察受精。實驗總計為 100 顆卵子，最後觀察精子與 卵子的原核 (pronucleus) 以及極體( polar body) 形成。
2. 精子移動至卵子能力測定(In vitro migration patterns assay)
利用horizontal column (Fig.7)來測試精子移動的能力(Hossain et
al., 1999)。取一 100mm 之 Petri dish，實驗組含 10 μg/ml OPN 之 HTF
培養液，製作column，做為精子游動之路徑。Column 共有 7 段轉 折(segment1-7)，每段長 5 公分寬 1.3-2.4 公分，並於 column 的頭尾 部分做一個圓滴當作精子儲存池，並於上方覆蓋礦物油(mineral oil)。將精子濃度調至 20 ×106/ml，至於 37℃，5%CO2 培養，於 4 小 時記錄其於最後一段(S7)所含精子量。記錄以 65℃使精子不再移動 各段column 精子細胞數。
3. 頂體反應試驗(Acrosome reaction assay)
觀察精子頂體反應之情形，利用 Spermac kit (Stain Enterprises, Onderstepoort, South Africa) 染色；包括 Fixative I、Stain solution A、
Stain solution B、以及 Stain solution C 四步驟染劑，實驗方法依照 Spermac kit manufacturer’s guidelines 所述步驟(Fig. 8)。待精液液化 後，將精子抹片於玻片上，於玻片完全風乾前加入Fixative I，室溫 靜置5 分鐘。
I. 將玻片清洗後，加入 Stain solution A，靜置 2 分鐘。
II. 清洗後，加入 Stain solution B，靜置 1 分鐘。
III. 清洗後，最後加入 Stain solution C，靜置 1 分鐘。
IV. 待玻片風乾後以 1000 倍於光學顯微鏡下觀察。
4. 老鼠體外受精試驗(mouse in vitro fertilization assay)
為觀察 OPN 對於精子與卵子之受精是否有影響，因此利用老鼠 體外受精實驗(Fig. 9)。將老鼠進行超排卵刺激(superovulation)，
自國家動物中心購買4-5 週大的 ICR 老鼠，飼養於台北醫學院大 學動物中心，且經過動物實驗管理小組(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)核准。動物室光照週期條件為 12 小時 光照，12 小時黑暗週期，在水、飼料充分供給的飼養環境至 8-10 週大，以腹腔注射方式施打 10IU 妊娠馬血清性腺刺激激素注射 液(pregnant mare serum gonadotropin, PMSG) (Sigma, St. Louis, MO)進行超排卵(superovulation)刺激。48 小時後，再於腹腔中注 射 10IU 人類絨毛膜促性腺激素(human chrorionic gonadotropin, hCG) (Profasi, Serono, Aubonne, Switzerland)於腹腔中。隔日自輸 卵管中取出卵子與公鼠輸精管取出之精子進行體外受精，於16-18 小時後，計算細胞內產生2 個原核(2 pronucleus)之胚胎數目。
5. 精子細胞骨架之螢光免疫染色
為了觀察精子之骨架蛋白(cytoskeletal protein)之表現，我們利用 actin、 spectrin 與 α-tubulin 抗體來測定其變化。精子固定於玻片 上並以PBS 清洗清洗之後置於 3% bovine serum albumin (BSA) 之
PBS 中 1 小時。 加入一級抗體，包括 actin、spectrin、α-tubulin ， 37 ºC 中培養一小時。培養過後加入二級抗體，FITC conjugate sheep anti-mouse IgG 或是 goat anti-rabbit IgG。Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG (Molecular Probes Inc., Plano, TX) 用以偵測 spectrin 於 spectrinactin 中之位置。在數次以 PBS 的清洗後，玻片以含 propidium iodide (Vector Laboratories, Prague, Czech Republic)封片。
最後以螢光顯微鏡觀察，並以confocal microscope (Leica TCS 4D, Heidelberg, Germany) 457~675nm laser 擷取影像。
五、 統計方法
每項實驗皆是重複三次以上所得，數據以平均值±標準差呈現。
並且使用Student’s t-test 統計法分析實驗組與對照組間的差異性。若 p value＜0.05 為兩組間具有顯著意義。
六、 病人權利之保護
本研究計劃經由醫院人體試驗委員會審查通過。