第五章 結論
第五節 研究目的
以蛋白質體學的方式來找出LYF-17 的標的蛋白(target protein)，以此為基 礎，希望在不久的將來能將LYF-17 應用在臨床乳癌的治療。
圖1-6：台灣地區 97 年癌症死亡率。〈資料來源：行政院衛生署〉
表1-2、LYF-17與其他臨床用藥測試癌細胞以及正常細胞的IC50濃度。
第二章 材料與方法 第一節 實驗材料
壹、 細胞株
MDA-MB-435 (乳癌細胞轉移能力較強的細胞株)(Khaldoyanidi et al., 2003; Zen et al., 2008)：由癌症生物學研究所洪明奇教授實驗室所贈，
China Medical University (Taichung, Taiwan)
貳、 實驗藥物(LYF-17)來源
LYF-17 得自於藥物化學研究所 郭 盛 助 教授實驗室， China Medical University (Taichung, Taiwan)
參、 藥品試劑
1. Acetone (MERCK, USA) 2. APS (USB, USA)
3. Acetonitrile (MERCK, USA) 4. Acetic acid (MERCK, USA)
5. Glycerol 99% (Riedel-deHaen, USA) 6. HCL 10N (Riedel-deHaen, USA)
7. Phenyl methame sulfonyl fluoride(PMSF) (Sigma, USA) 8. Sodium phosphate(Na2HPO4) (J.T.Baker, USA)
9. Sodium acetate (calblochen, USA) 10. Sodium bicarbonate (Sigma, USA)
11. Sodium othorandate(Na3VO4) (Sigma, USA)
12. Sodium dodecyl sultate(SDS) (Sigma, USA) 13. Sodium hydroxide(NaOH) (Riedel-deHaen, USA) 14. TRIS-HCL (J.T.Baker, USA)
15. Sodium thiosulfate(Na2S2O3) (MERCK, USA) 16. Sodium carbonate(Na2CO3) (MERCK, USA) 17. Urea (MERCK, USA)
18. DTT (MERCK, USA) 19. IAA (MERCK, USA)
20. CNBr-activated SepharoseTM4B (奇異, USA) 21. Ethanol (MERCK, USA)
22. Methanol (默克, Germany) 23. Bradford (BIO-RAD, USA) 24. FBS (GIBCO, USA)
25. Trypsin (GIBCO, USA) 26. TCA (Sigma, USA)
27. Protein maker (Femantas, USA)
肆、 主要器材儀器
1. 離心機(AvantiTM30 centrifuge, Beckman Coulter, USA) 2. 去離子水製造機(Minipore, USA)
3. 蛋白質轉漬電泳套組(BIO-RAD. USA) 4. 微量天平(GR-200；A&D, Japan)
5. 正立式光學顯微鏡 (ZEISS, Germany)
6. ELISA reader (ANTHOS-2020, Salzbrug, Austria) 7. Power supply (Hoefer, San Francisco, CA, USA) 8. SDS-PAGE 電泳槽套組 (BIO-RAD, USA)
9. Vortex-genie 2 (SCIENTIFIC INDUSTRIES, NY, USA) 10. 蛋白質掃描儀分析系統 (U MAX, USA)
11. 細胞培養皿 (CORNING, USA) 12. 酸鹼值測定計 (C831；Consort, UK)
第二節 實驗方法
壹、 細胞株培養與繼代
HBL-100：培養於90%的DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium)，
包含有10%的FBS (fetal bovine serum)、1%青黴素與鏈黴素的混合抗生素 (100X stock solution ：Penicillin 50 U/ml；Streptomycin 50 μg/ml，Gibco) MDA-MB-435：培養於90%的DMEM/F12，包含有10%的FBS (fetal bovine serum)、1%青黴素與鏈黴素的混合抗生素 (100X stock solution：
Penicillin 50 U/ml；Streptomycin 50 μg/ml，Gibco)
上述細胞株皆培養於5%CO
2，恆溫37℃的細胞培養箱中，每隔48小 時以trypsin-EDTA(0.05% trypsin與2.5 mM EDTA)將細胞打散，以1×106個 細胞數分種於新的10公分培養皿中做繼代培養。台內。自液態氮中取出冷凍小管，首先檢查蓋子是否旋緊（由於熱脹冷
標示清楚之冷凍保存管中（1 ml/vial）。冷凍保存方法：冷凍管置於-80℃
胞培養箱中反應），再加入3 ml 10% FBS-DMEM 中斷 trypsin 作用，將 (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheny tetrazolium bromide)進入細胞內 而 被 粒 線 體 內 膜 上 的 琥 珀 酸 去 氫 酶 (Succinate dehydrogenase on Mitochondrial inner membrane)給還原成MTT，不溶於水，呈現紫色針狀 結晶；因為只有在活細胞中其粒線體才有活性，因此只有活細胞才會生 成結晶，在結晶完全形成之後，會結在細胞上造成細胞死亡，再用DMSO 溶出結晶，用595 nm的波長在ELISA reader下讀取吸光值。
細胞以2×104/well種於24孔盤中，24小時後，換成含有指定濃度指定 藥物的培養液(一個孔0.5 ml），培養24小時後，加入MTT試劑 (MTT 2 mg/ml 溶於PBS中）反應3小時待結晶形成，將24孔盤中的培養液與試劑
吸乾，加入500 ml的DMSO溶解結晶，取200μl溶解液至96孔盤中以590 nm 之波長在ELISA reader下讀取吸光值。
陸、 細胞總蛋白收集與定量
細胞以1×106個種植於10公分培養皿中，待16~20小時細胞貼附後，
給予指定劑量的LYF-17並培養指定的時間於細胞培養箱中。待處裡後，
將各組別的細胞用trypsin-EDTA打下連同培養液一起收集至15 ml離心管 中，離心1500 rpm、5分鐘。去除上清液，加入1 ml PBS將細胞打散，離 心1500 rpm、5分鐘。將上清液倒乾，加入1 ml PBS將細胞打散並轉到1.5 ml eppendorf，離心12000 rpm、1分鐘。用微量吸管確實吸乾上清液，收 集的細胞可存放於-80℃冰箱一個月備用。
將收集的細胞加入適量的lysis buffer (10% glycerol；1% Triton X-100；137 mM NaCl；10 mM NaF；1 mM EGTA；5 mM EDTA；1 mM sodium pyrophosphate；20 mM Tris-HCl，pH 7.9；100 mM β-glycerophosphate；1 mM sodium orthovanadate ； 0.1% SDS ； 10μg/ml aprotinin, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and 10 μg/ml leupeptin)置於冰上，每10分鐘 震盪一次(以”vortex 9”速度震盪)。待震盪三次後，再以超音波震盪1分鐘，
最後離心12000 rpm、30分鐘、4℃。以微量吸管吸取上清液，收集於新的 eppendorf中，此上清液即為細胞總蛋白(total protein)。當總蛋白質定量
後，以每管50μg的蛋白質分裝儲存於-20℃備用。
蛋白質定量，以Bio-Rad Protein Assay Dye來測定。其原理簡述如下，
Bio-Rad Protein Assay Dye中酸性的Coomassie® Brilliant BlueG-250會與 蛋白質結合，而蛋白質濃度不同會使溶液顏色呈現不同程度的變化，通 常蛋白濃度介於0~20μg/ml時，溶液顏色將會由棕紅色轉灰黑色，最後變 成深藍色。取稀釋的Bio-Rad Protein Assay Dye (1:4 Milli Q水) 1 ml分別加 入0、1、2、4、6、8、10μl的BSA (Bovine serum albumin 2 mg/ml)，混合 均勻後，取200μl之混合液至96孔盤，以595 nm之波長在ELISA reader 下 讀取吸光值，並以此七點對應之吸光值建立檢量線 (回歸系數須大於 0.995才可採用)。取待定量之蛋白質液2μl混合於1 ml稀釋的Bio-Rad Protein Assay Dye，取200μl之混合液至96孔盤，以595 nm之波長在ELISA reader下讀取吸光值，並以建立好的檢量線換算蛋白質濃度。
接著在4℃下，以 13000 rpm的轉速離心 15 分鐘，去除上清液，重複此步 驟 2 次，得到蛋白質沉澱物。再將-20℃ 的丙酮（acetone）加入蛋白質 沉澱物中並離心（13000rpm、15 分鐘、4℃），重複此步驟 3～5 次，之後
靜置在室溫下讓丙酮自然揮發（不可使蛋白質沉澱物變至白色）。在室溫
下，加入適量的回溶液（rehydration buffer）將沉澱的蛋白質回溶，接著 將蛋白質回溶液以13000 rpm 的轉速，離心 20 分鐘，取上清液為蛋白質 溶液，進行等電點電泳分析。
註：*表示在使用前才加入
(B) 等電點聚膠電泳分析（iso-electric focusing，IEF）
原理：利用蛋白質等電點不同的特性，使用具有 pH 值梯度分布的 IPG
意正負極擺放位置），設定程式進行等電點聚膠電泳。IEF Cell 的參數設 定如下：
R（rehydration）: 50 V、12 hr Step1: 250 V、15 min
Step2: 4000 V ↗ 2 hr
Step3: 4000 V ↗ 20000 Vhr Step4: 500V/hold
(C) strip 膠條平衡
條面朝上的放入拋棄式水合盤中的另一個well 中，注入 2.5 ml 平衡液 II
（equlibration buffer II），於迴旋式震盪器上搖晃 20 分鐘。
(D) SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）
原理：利用電泳所造成的三種物理效應（樣品濃縮效應、分子篩效 在最前面；在電極緩衝液中的glycine（甘胺酸），其在pH 8.8 的環境下易 解離出甘胺酸根（NH2CH2COO-），但在pH 6.8 時，glycine解離度卻很小
（僅有 1- 0.1%），因而在電場中遷移很慢﹔而SDS-蛋白質複合物因也是 帶負電荷，因此也是向正極移動，但其有效遷移率（有效遷移率=mα，m 為遷移率，α為解離度）卻是介於氯離子與甘胺酸根離子之間，因此蛋白
質樣品夾在氯、甘胺酸根離子界面之間被濃縮。
3. 電荷效應 隙中（strip 膠條與膠片接觸處，不可有氣泡），然後小心將水層倒出（strip 膠條仍需緊貼於膠片上緣），吸取約1 ml 的覆蓋膠注入膠片上緣空隙中，
放置於 4℃中幫助覆蓋膠凝固。待覆蓋膠凝固後，將膠片架設到電泳槽
中，加入跑膠用之緩衝液（running buffer），以固定電壓 100 V、90 分鐘 進行電泳步驟。
solution），以迴轉式震盪器搖晃30分鐘，接著再置換成二次水，潤洗膠 片2～4次，每次20分鐘。然後加入50 ml銀染反應試劑（silver reaction solution）顯色至點（spot）的出現（顯色的時間依蛋白質濃度而定），
倒掉銀染反應試劑，加入終止液（stop solution）反應15分鐘，終止顯色 反應。再置換成二次水，潤洗膠片2次，每次5分鐘。最後可將膠片置於 二次水中，保存於4℃。
(F) 二維電泳膠影像掃描、分析
將膠片放在掃瞄器上，使用軟體 PDQuest 7.1.0 進行掃瞄及分析。水 平的方向代表等電點值，由左至右增加，垂直的方向為分子量大小，由 上至下減少。
(G) 蛋白質鑑定
將送往明欣生物科技公司做出的二維膠體電永結果中，挑選出經由 藥物接到的相關蛋白點（spot），強度為前二十強者，以微量尖頭吸管（tip）
將點切割下來，分別收集在裝有二次水的微量離心管中，送中國醫藥大 學蛋白質體學中心做質譜分析（LC/MS-MS）鑑定，並經由MATRIX SCIENCE的Mascot Search 比對MS/MS的鑑定結果。
第三章 研究結果 達到抑制正常細胞生長，不過，由於投予LYF-17 對於MDA-MB-435 的IC50 比針對正常細胞HBL-100 的濃度還要低，也就是當我們對乳癌細胞 的蛋白。首先將LYF-17 接到 Sepharose (CNBr Sepharose-4B)上，之後再 利 用 凝 膠 過 濾 法 （gel filtration ）， 也 稱 為 排 阻 層 析 （ exclusion chromatography）、凝膠層析（gel chromatography）或分子篩層析（molecular sieve chromatofraphy）來分離出蛋白，接著利用二維電泳的結果(圖 1-8)，
從二維電泳膠上 424 個蛋白質點中先挑選出強度較強的前二十個蛋白質 點切取下來，作膠體內蛋白質水解(In-gel digestion)，用 MALDI-TOF 分 析，經過 MASCOT 資料庫比對，得到八個不同的蛋白質(詳見表 1-3)，
這幾個個蛋白質極有可能是LYF-17 的標的蛋白。
第四章 討論
SDS-PAGE 膠體比例的調整，2-DE→MALDI-TOF→MASCOT 將能近乎 全方面的篩選出被LYF-17 所聯結上的各種蛋白質。但是，蛋白質體學研 究方式所帶來的大量結果數據及相關資訊的分析處理和判讀，甚至比實 驗操作本身更為艱難費時。並且，2-DE→MALDI-TOF→MASCOT 研究 結果必須配合其他實驗方式，例如western blotting，Q-PCR，螢光染色等，
以驗證2-DE 結果及推論。
從二維凝膠電泳開始一直到 MASOCT 資料庫比對是一連串環環相 扣的實驗操作，當中任一步驟的差錯都可能造成樣品汙染或最後數據判 讀的困擾。在本實驗中，利用CNBr-Sepharose 4B 接上藥物，利用膠體分 離法過濾出與LYF-17 有相互結合的蛋白質，這樣的實驗結果與其他蛋白 質體學研究方法比較起來，會沒有相對的蛋白質點可以選擇挖取跟比 較，只能憑藉蛋白質點的強度來做選取。
這些蛋白質點經 MALDI-TOF→MASCOT 分析後，會因為人為設定
模式的不同，相同的序列卻會比對出不同的蛋白質。加上資料庫會不定 期的更新，有可能這一個月分析比對出來的蛋白質，幾個月後再去比對，
卻發現序列比對上有更相似的蛋白質，導致最初始的蛋白就因此而被取 而代之。雖然，蛋白質體學研究方法可以很快速的進行系統性的蛋白質 分析，不過與藥物相互作用的蛋白準確性，除了勤奮搜尋資料庫外，其 餘就得依賴其他實驗方式來幫助驗證了。
分析出來的的八個點中，CD44 與癌症轉移之關係非常密切。腫瘤形 成之過程與一些正常生理反應非常相似，如胚胎發育、傷口的癒合等，
都需要細胞的增殖與細胞的移行。在這些位置會有玻尿酸的累積及CD44 主導之細胞間與細胞間質作用，因此 CD44 在腫瘤形成過程(包含癌症的 轉移)，扮演相當重要的角色。CD44 除了是一個細胞外基質成份(如：玻 尿酸)的接受器(Aruffo et al., 1990)，也參與了一些細胞反應，包括：淋巴 球的 homing (Goldstein et al., 1989)、細胞的移動 (Svee et al., 1996;
Thomas et al., 1992)以及癌症的轉移和侵入(Gunthert et al., 1991; Svee et al., 1996; Takahashi et al., 1999; Yu and Stamenkovic, 1999)等等。往後抗癌 的研究，或許可以著重於這個蛋白質去進行探討。
第五章 結論
由實驗結果可得知，LYF-17 結合到的標的蛋白有：Protein disulfide
由實驗結果可得知，LYF-17 結合到的標的蛋白有：Protein disulfide