研究目的

實驗室在之前的研究中已經對於苯基偶氮苯磺胺類衍生物做初 步的毒性分析，也知道此類化合物對於纖維化的 A1-40 有抑制的效 果 (Lin et al., 2004)，因此實驗中將會試著在 in vitro 的狀態下製備 A-，並且以 Th-T 螢光染色分析 A 聚集的過程中此類化合物抑 制 A1-42 聚集的能力。

首先在 in vitro 的條件下製備 A1-42，並利用原子力顯微鏡觀察 A- 聚集過程中各階段的結構，並且觀察製備出來的 A 結構對 於大腦皮質神經元培養至第五天 (5 days in vitro，DIV5) 及 Neuro-2a 細胞在毒性表現的影響。

另外在苯基偶氮苯磺胺類衍生物、A- 及 Th-T 共培養下觀 察 A1-42 聚 集 過 程 ； 並 以 原 子 力 顯 微 鏡 觀 察 此 類 化 合 物 對 於 A- 結構的影響，並且測試苯基偶氮苯磺胺類衍生物是否在破壞 A- 聚集後得以降低其產物對神經元的毒性。

第二章 材料與方法

第一節、試藥與儀器

(一) 試藥

Ammonium peroxodisulfate 購自 Merck (Cat. No. 1.01201)

Amyloid -protein, fragment 1-42 (A1-42) 購自 Biosource (Cat. No.

03-112)

B-27 supplement 購自 Invitrogen (Cat. No. 17504-044) Boric acid 購自 Merk (Cat. No. 1.00165)

Calcein acetoxymethyl (AM) 購自Invitrogen (Cat. No. F-6867) Calcium chloride dihydrate 購自 Merck (Cat. No. 1.02382) Cytosine β-D-arabinofuranoside 購自 Sigma (Cat. No. C 6645) 1,4-Diazobicyclo-[2.2.2]-octane (DABCO) 購自 Sigma (Cat. No. D 2522)

Diethyl ether 購自 Merck (Cat. No. 1.00921) Dihydroethidium 購自 Sigma (Cat. No. D7008)

Dimethyl sulfoxide (DMSO) 購自 J.T. Baker (Cat. No. 9224-03)

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 購 自Sigma (Cat. No. M 2128)

Disodium hydrogen phosphate 購自 Merck (Cat. No. 1.06586)

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) 購自 Invitrogen (Cat. No.

31600-034)

Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 購自 Merck (Cat. No.

1.08417)

F-12 nutrient mixture 購自 Invitrogen (Cat. No. 21700-075) Fetal bovine serum (FBS) 購自 Invitrogen (Cat. No. 21640-079) HEPES 購自 BDH (Cat. No. 44285 6A)

Hexafluoroisopropanol 購自 Sigma (Cat. No. H8508) Hibernate A 購自 BrainBits (Cat. No. 6180404) Hydrogen chloride 購自 Merck (Cat. No. 1.00317) Leupeptin 購自 Sigma (Cat. No. L 2884)

2-Mercaptoethanol 購自 Merck (Cat. No. 1.15433) Methanol 購自 BDH (Cat. No. 15250)

N,N´-Methylene-bis-acrylamide (bis-acrylamide) 購自 Sigma (Cat. No.

M 7279)

Minimum essential medium (MEM) 購自 Invitrogen (Cat. No.

41500-034)

Mouse anti-MAP-2 antibody 購自 Upstate Biotechnology (Cat. No.

05-346)

Neurobasal medium 購自 Invitrogen (Cat. No. 21103-049) Papain 購自 Sigma (Cat. No. P 4762)

Paraformaldehyde 購自 Sigma (Cat. No. P 6148)

Penicillin and Streptomycin 購自 Invitrogen (Cat. No. 15140-122) Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) 購自 Sigma (Cat. No. P 7626) Poly-L-lysine 購自 Sigma (Cat. No. P 1274)

Potassium chloride 購自 Merck (Cat. No. 1.00731)

Potassium dihydrogen phosphate 購自 Merck (Cat. No. 1.04873) Sodium chloride 購自 Merck (Cat. No. 1.06404)

Sodium dihydrogen phosphate monohydrate 購自 Merck (Cat. No.

1.06346)

Sodium hydrogen carbonate 購自 Merck (Cat. No. 1.06329) Sodium nitrite 購自 Merk (Cat. No. 1.06549)

Triton X-100 購自 Sigma (Cat. No. X 100)

Trizma base (Tris) 購自 Bio-Rad (Cat. No. 161-0719) Trypan blue 購自 Sigma (Cat. No. T 8154)

Tween 20 購自 Merck (Cat. No. 8.22814)

(二) 儀器

Agilent 5400 atomic force microscopy

Bio-Tek PowerWavex microplate scanning spectrophotometer Beckman model J2-21 centrifuge

Beckman coulter optima L-90K ultracentrifuge

FUJIFILM LAS-3000 science imaging system/FUJIFILM Multi Gauge analysis

SpectraMax M5

Leica DMIRB Fluorescence microscope

Leica TCS SP Confocal laser-scanning microscope Meta imaging series 7.1 software

二、材料

(一) 細胞株 (cell line)：

Neuron 2a cells

(二)初級細胞組織培養 (primary culture)來源：

Postnatal day 1 Sprague-Dawley rat：購自國立陽明大學動物中心

第二節、實驗方法

A 之製備

將冷凍乾燥的 Human A 取出靜置於室溫下回溫，加入

1,1,1,3,3,3-Hexafluro-2-propanol (HFIP) 溶解 A，濃度為

00 M，

在室溫下靜置 1 天以去除原先已存在之結構，以 Hamiltom 注射器分 裝，並且以氮氣將 HFIP 吹乾，存放於 -20°C 備用。

大白鼠大腦皮質神經元培養

根據 Giulan-Baker 的方法 (Giulan and Baker et al., 1996)，將新 生大白鼠 (Sprague-Dawley) 以乙醚迷昏，剪下頭部，取出大腦皮質，

清除腦膜後，將大腦皮質切碎，放入 Hibernate A/B27 培養液，30°C 反應 8 分鐘。取出下層皮質細胞，放入含 0.3 mg/ml papain 的 Hibernate A 培養液中，在 30°C 以 180 rpm 震盪反應 15 分鐘以水 解組織中細胞間質蛋白。取出細胞團塊，在 Hibernate A/B27 培養液 中將細胞打散成懸浮狀，以 600×g 離心 1 分鐘，將上清液吸掉，取 出細胞至 0.9M Sucrose 溶液，以 750×g 離心 10 分鐘，取出細胞以 40 m 孔徑之細胞過濾器去除細胞團塊。將神經元以 5x10⁴ cells/cm² 密 度 培 養 於 coating poly-L-lysine 之 24-wells 培 養 盤 中 ， 以 Neurobasal/B27 培養液培養於 37°C、5% CO2/ 9% O2 環境。培養第

3 天加入 5

M cytosine -D-arabinofuranoside，以抑制膠細胞增生，

第四天將培養液換回 Neurobasal/B27 培養液，37°C、5% CO2 / 9% O2

環境下繼續培養。A1-42 之神經元毒性測試在培養之第五天進行。

Neuro 2a 細胞培養

Neuro 2a 是一個來自於成年小鼠腦部的神經母細胞瘤細胞株，

Neuro 2a 細胞培養於含有 10% FBS 的 MEM 培養液的中，之後置 於 5% CO₂， 37℃ 培 養 箱 ， 分 析 前 則 先 種 於 24-wells 培 養 盤 (2.5×10⁴ cells/cm²) 中，隔天則換成含 1% FBS 的 MEM 培養液。

A1-42 之神經毒性測試在培養之第三天進行。

Thioflavin-T (Th-T) 染色分析

A1-42 聚集即時測定方法修改自 Yoshiike 等人 (2001) 之方法。

簡述之，將 A 溶於不同溶劑 (如表一) 之溶液 (100 M, 50 l)、溶 於 PB 之 Th-T 溶液 (1mM, 200

l) 和溶於 DMSO 之抑制劑溶液

(1mM, 0-2.5 l)混合後置於 4℃、22℃ 和 37℃ 反應並在 48 小時內 測定 A1-42/Th-T 之即時螢光強度 (激發光 450 nm，放射光 482 nm)。

MTT 還原測定

吸除 24-wells 細胞培養盤中培養液，每個 well 中加入含 0.3 mg/ml 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 且不含血清的 MEM 培養液 300 l，置於 37℃ 下培養一小 時，吸除培養液，加入 200 l DMSO 以溶解 formazan。吸取 180 l 培養液至 96-wells 培養盤中，以 ELISA reader 測量波長 600 nm 下 的吸光值。

AFM 實驗及試片製備

將 A- 溶於 Milli-Q 水 (100 M)，培養在 37℃，於 0、6、

24、48 小時取出稀釋為 20 M (Milli-Q水)，點在雲母片上，雲母片 使用前必須將最上層撕除以暴露出平整的表面，在室溫下靜置 5 分 鐘使 A 附著到雲母片上，以 Milli-Q 水清洗去除多餘的 A，並且 以 tetrafluoroethane 吹乾，放置於室溫中保存。

Ethidium homodimer cell viability assay

Calcein AM 為可穿透細胞膜的螢光指示劑，進入細胞後，Calcein AM 的 lipophilic blocking group 會被 esterase 切除，以帶電荷形式 存在，不易離開細胞，可用來研究活細胞，而 ethidium homodimer 是具有紅色螢光的指示劑，會穿透破裂的細胞膜，並將其細胞核染色。

加入 1.5

M Calcein-AM 及 ethidium homodimer 於待測細胞中，

37°C 反應 30 分鐘，以 HBSS 緩衝液洗 3 次，螢光顯微鏡或雷射 掃描共軛焦顯微鏡觀察。

統計分析

實驗數據間之差異以 ANOVA 之 post hoc multiple comparison 合併 Bonferroni test 來分析。* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001。

第三章、實驗結果

第一節、Thioflavin-T (Th-T) 染色分析 A1-42 聚集能力

傳統的 A 聚集測定是在 A 溶液完成聚集反應後將 Th-T 溶 液加入測定 A1-42/Th-T 之螢光強度，此種測定只能測量反應終點 之聚集程度而無法觀察聚集反應之動力學變化。為了要觀察 A1-42 的整個聚集過程，我們修改 Yoshiike 等人 (2001) 之測定方法以執 行 A1-42 聚 集 之 即 時 測 定 (real-time detection) 測 定 方 法 是 將 A1-42 溶於不同溶劑 (如表一) 之溶液 (100 M, 50 l) 和溶於 PB 之 Th-T 溶液(1 mM, 200

l)混合後置於 4、22 和 37℃ 反應並在

48 小時內測定 A1-42/Th-T 之即時螢光強度 (激發光 450 nm，放 射光 482 nm)。結果發現 A1-42 在 Milli-Q 水製備下，Th-T 的螢 光值有隨著時間及溫度增加而上升，在 4、22 及 37°C 反應 48 小 時後分別增加為反應前的 1.13、1.24 及 1.77 倍(圖 1A)。而在 10 mM HCl 水溶液製備下，Th-T 的螢光值也隨著時間及溫度增加而上 升，在 4、22 及 37°C 反應 48 小時後也分別增加為反應前的 1.13、

1.31 及 1.55 倍(圖 1B)。另外 A 在 PBS 及 F-12 培養基製備下，

並沒有顯著的 Th-T 螢光值變化。(圖 1C.D)

第二節、原子力顯微鏡觀察 A1-42 聚集的結構

將 HFIP 處理過的乾燥 A1-42 溶於 Milli-Q 水中，濃度為 100

M，靜置於 37°C 並以原子力顯微鏡 (AFM) 分別觀察在 0 小時、

6 小時、24 小時、48 小時的結構變化。利用原子力顯微鏡可以偵測 到 A1-42 隨時間變化的結構發展過程。圗 2 為 20 M A1-42 溶 於 Milli-Q 水在室溫下培養 0、6、24、48 小時的結果，一開始可以 看到 0 小時的 A1-42 是球狀顆粒的形態(圖 2A)。到 6 小時後出 現各種大小及形態的團狀和條狀等類似 protofibril 的結構，而這些 protofibril 是由類似 oligomer 狀的結構所排列形成串珠狀的結構，

平均高度都在 40 nm 以下 (圖 2B)。

當培養至 24 小時，可以很明顯的看到類似纖維狀 (fibrils) 的結 構產生，其長度都超過 1m，附近的小顆粒也漸漸減少，但高度沒 有增加，其沿著橫向伸展 (圖 2C)。隨著時間培養至 48 小時(圖 2D)，

類似纖維狀的長度有長有短，寬度變得較粗大。由 Th-T 染色分析及 AFM 圖像可得知用 Milli-Q 水製備 A1-42，確實是會促使聚集堆 疊形成 protofibril 或類似 fibril 的結構。

第三節、A1-42 fibril 對於大白鼠大腦皮質神經元培養的影 響

以 AFM 確認由 Milli-Q 水所製備的 A1-42 結構上特性之後，

利用大白鼠大腦皮質神經元觀察其對於神經元的毒性，在神經元培養 的第五天加入由 Milli-Q 水所製備的 A1-42 fibril 處理 24 小時之後，

以 MTT assay 觀察 A1-42 濃度 0~2

M 對於神經元的毒性 (圖

3)。結果發現由 Milli-Q 水製備的 A1-42 fibril，在濃度 0.2~1.5 M 都會對神經元有些微的毒性作用，跟對照組比 MTT reduation 降低了 約 6~20%，而在 2 M 有明顯的毒性，其 MTT reduation 降低為對 照組的 35±2.27%。故以 Milli-Q 水製備出的 A1-42 fibril 對大腦皮 質神經元是具有毒性。

而為了探討由 Milli-Q 水所製備的 A1-42 結構是導致神經元 進行 apotosis 或是 necrosis，以 Ethidum homodimer necrosis assay 進行觀察。在共軛焦顯微鏡的影像中可以看到由 Milli-Q 水製備的 A1-42 會造成 necrosis 細胞的增加 (圖 6A)，且經 A1-42 處理過 的神經元，受到 Calcein AM 染色的比例隨著 A1-42 fibril 濃度增 加而呈現減少的趨勢 (圖 6B)。

第四節、A1-42 fibril 對於 neuro 2a 細胞的影響

以 AFM 確認由 Milli-Q 水所製備的 A1-42 結構上特性之後，

利用 neuro 2a 細胞觀察其對於神經細胞株的毒性，neuro 2a 細胞培 養於含有 10% FBS 的 MEM 培養液的中，處理前換成含 1% FBS 的 MEM 培養液後，加入由 Milli-Q 水製備一天的 A1-42 fibril 處 理 24 小時之後，用 MTT assay 觀察 A1-42 fibril 濃度 0~2 M 對 於 neuro 2a 細胞的毒性 (圖 7)。結果發現 A1-42 fibril 濃度 0.2、

0.5 和 1

M ， 分 別 對 neuro 2a 細 胞 有 著 24±2.57 、 33±3.4 和

41±0.99% 的 毒 性 ， 而 在 更 高 濃 度 1.5 和 2

M 的 42±2.36 和

38.54±4.9% 毒性跟 1

M 的 41±0.99% 沒有顯著差別，所以由

Milli-Q 水製備的 A1-42 fibril 1

M 就可以造成 neuro 2a 細胞約

40% 的毒性。

第五節、苯基偶氮苯磺胺類衍生物對於 A1-42 聚集之影響

以 Th-T 染色分析苯基偶氮苯磺胺類衍生物抑制 A1-42 聚 集之效果，先前已經分析過四種溶液對於 A1-42 聚集的能力，決定 是用 Milli-Q 水溶液培養在 37℃ 下來做此實驗。苯基偶氮苯磺胺類 衍生物抑制 A1-42 聚集之即時測定是將 A1-42 溶於 Milli-Q 水 之溶液 (100 M, 50 l)、溶於 PB 之 Th-T 溶液 (1 mM, 200 l) 和 溶於 DMSO 之抑制劑溶液 (1 mM, 0-2.5 l) 混合後置於 37℃ 反應 並在 48 小時內測定 A1-42/Th-T 之即時螢光強度 (激發光 450 nm，放射光 482 nm)。結果發現所測試的苯基偶氮苯磺胺類衍生物 B1~B11 和 B15 對 A1-42 聚集都有抑制的效果 (圖 9)。每個苯基 偶氮苯磺胺類衍生物的 IC50 濃度如表格二。

第六節、A1-42 聚集受到苯基偶氮苯磺胺類衍生物抑制後 的產物對大白鼠大腦皮質神經元之毒性測試

將苯基偶氮苯磺胺類衍生物 (1

M) 與 A1-42 溶於 Milli-Q

水 (100 M) 混合培養在 37℃ 反應 24 小時後，加入大腦皮質神經 元培養中處理 24 小時，再以 MTT 還原試驗測試抑制 A1-42 聚 集後的產物，濃度為 0.2、0.5 和 1

M 的細胞毒性 (圖 10)。結果

發現正向對照組的 B15 (圖 10 a)，抑制聚集後從原本 6~16%的毒性 提高到 12~18%，其它的 B1~B11 (圖 10 b~l) 抑制後的毒性也都比 對照組來的高或者一樣，沒有降低的跡象，尤其以 B9 和 B10 (圖 10 j，k) 最為顯著，B9 抑制後毒性提高到 20~37%，則 B10 是15~28%，

而 B7 和 B8 (圖 10 h，i) 抑制後跟原來對照組毒性相似。結果得知，

苯基偶氮苯磺胺類衍生物抑制 A1-42 聚集後的產物，對大腦皮質神 經元依然存在著毒性，而且有加強毒性的傾向。

第七節、A1-42 聚集受到苯基偶氮苯磺胺類衍生物抑制後 的產物對neuro 2a 細胞培養的毒性測試

將苯基偶氮苯磺胺類衍生物 (1

M) 與 A1-42 溶於 Milli-Q

水 (100

M) 混合在 37℃ 培養 24 小時後，加入 neuro 2a 細胞培

養中處理 24 小時，再以 MTT 還原試驗測試抑制 A1-42 聚集後 的產物，濃度為 0.2、0.5 和 1

M的細胞毒性 (圖 13)。結果發現

正向對照物的B15 (圖 13 a) 卻沒有顯著的影響；B1 (圖 13 b)，在 0.2 和 0.5

M 毒性減少至 10 和 7%，但在 1 M 卻沒有降低毒性。

其它苯基偶氮苯磺胺類衍生物中的 B2、B3、B5、B6、B7 和 B9 (圖 13 c，d，f，g，h 和 j) 的毒性測試結果跟 B1 相似，都是在 0.2 和 0.5

M 有 毒 性 減 少 ， 且 當 中 的 B2 和 B7 ( 圖 13 b 和 h) 在

1

M 分別減少至 30 和 25% (對照組是 45%)。其 B8 和 B11 (圖

13 i 和 l) 結果跟正向對照物的 B15 相似，沒有受到影響。而 B4 和 B10 (圖 13 e 和 k) 只有在 0.2

M 有減少毒性。結果得知，大部

分苯基偶氮苯磺胺類衍生物抑制 A1-42 聚集後的產物對 neuro 2a 細胞是有降低毒性的效果。

第四章、討論

探討 A1-42 與 Thioflavin-T 聚集的條件

在先前的文獻中已知 10 mM HCl 水溶液、Milli-Q 水、PBS (Hepler et al., 2006) 及 F-12 medium (Stine et al., 2003)，都會促使 A1-42 聚集，而為了知道 A1-42 溶於上述溶液之即時聚集反應 (real-time reation)，我們將 A1-42 與 Thioflavin-T 共同培養來觀察 A1-42 聚集的時間曲線。由於已知 Thioflavin-T 可以檢測類澱粉纖 維的存在 (LeVine, 1993)，所以把 A1-42 溶於四種溶液在不同培養 溫度下觀察的 Th-T 螢光放射強度的時間變化。隨著反應時間延長，

螢光訊號會逐漸上升，表示溶液中的 A1-42 開始有些許的纖維結構 形成，在 4℃ 與 22℃ 的系統中 Th-T 螢光值一開始並沒有明顯上 升，但 37℃ 的實驗則於培養 4-6 小時之後螢光值即明顯上升。若 比較 48 小時後之螢光值也可發現，隨著培養溫度的升高，最後達成 聚集平衡時的螢光值也會越高，這表示溫度越高，A1-42 聚集形成 的纖維結構越多。若對照由 AFM 所得到之影像圖，A1-42 在 37℃

培養 24 小時後則呈現一些較細短的纖維結構。由 Th-T 螢光及

培養 24 小時後則呈現一些較細短的纖維結構。由 Th-T 螢光及

在文檔中 以 amyloid 聚集為藥物標的 (頁 28-0)