研究背景與動機

Carbazole 最早是在 1872 年被 Graebe 與 Glazer 在瀝青中所分離 出來的成分。2002 年，Knolker 在文獻中提及由 Chakraborty 等人自 murrayanine 中分離出該成分並發現其具有抗菌活性 ⁴⁶。

而文獻上也陸陸續續發現 carbazole 類衍生物具有很多重要的藥 理活性，包括抗腫瘤、抗微生物、抗黴菌、抗 HIV 病毒、抗氧化及 神經保護的作用…等^47-49。

後來，自本所博士班李春燕學姊之論文中發現，carbazole 類衍生 物對 leukemia cell lines (HL-60, U937, K562)皆具有促使細胞凋亡之活 性⁵⁰。故延續 carbazole 類化合物對於抗白血病細胞活性之研究，篩 選一系列 3,6-Substituted 9-pyridylmethylcarbazole 之衍生物，以期開發 出更具活性之化合物。

第二章 實驗材料與方法

第一節 實驗材料與儀器

(一)藥品

1. 3,6-Substituted 9-pyridinylmethylcarbazole derivatives (本所碩士 班黃雅玲同學所合成)

2. 購自 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)

 Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)

 Trypan blue solution, 0.4 %

 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)

 Nitroblue tetrazolium (NBT) 3. 購自 BIOWEST (France)

 RPMI 1640 culture medium

4. 購自 Gibco laboratories (Grand Island, NY)

 Antibiotics (Penicillin, Streptomycin)

 Fetal bovine serum (FBS)

 L-Glutamine

 10 × Dulbecco’sHanksbalanced saltsolution (HBSS) 5. 購自默克公司 (Germany)

 Dimethyl sulfoxide (DMSO)

 99.5 % Ethanol

(二)溶液的配置

 NBT solution

秤取 NBT 粉末 20 mg，溶於 20 mL HBSS 中，旋拌均 勻後，再加入PMA 100 μg。

 MTT solution

秤取 MTT 粉末 100 mg，溶於 20 mL 去離子水中，使 其最後濃度為 5 mg/ mL。

(三)實驗儀器

 流式細胞儀 (Becton Dickinson, Flow Cytometry)

 垂直式無菌操作檯 (NUAIRE, Class II type A/ B3)

 直立式光學顯微鏡 (Olympus, CH-20)

 倒立式光學顯微鏡 (Nikon Ellipse, TE300)

 高速離心機 (Hettich, universal 32 R)

 可控溫式二氧化碳培養箱 (NUAIRE, Air-Jacketed DH Autoflow Automatic CO2Incubator)

 控溫培養箱 (TKS, Incubator LT1600)

 血球計數盤 (SUPERIOR, Hemocytometer)

 酵素免疫分析儀 (Anthos Labtec Instruments, 2001)

(四)細胞株(HL-60 cell line)

 人類前骨髓性白血病 (細胞 Human promyelocytic

leukemia cells)，屬懸浮性細胞，可用 RPMI-1640 culture medium 培養之；來自於美國 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)

第二節 3,6-Substituted 9-pyridylmethylcarbazole 衍生物 之加藥處理

將一系列共 26 種 3,6-substituted 9-pyridylmethylcarbazole (HYL) 衍生物以 DMSO 溶解，並將其儲存於-20 ℃冰箱內，待加藥時再解凍 之。加藥時，DMSO 的濃度需控制在 0.1 %以下，以避免 DMSO 本身 對於 HL-60 cells 的影響。

第三節 人類前骨髓性白血病細胞(HL-60 cells)的培養

HL-60 cells 培養在溫度 37 ℃、溼度 95 %、5 % CO2之培養箱中。

並用含有 10 %胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、1 % L-glutamine、

100 units/ mL penicillin 和 100 μg/ mL streptomycin 的培養基(RPMI-1640 medium)培養之。期間不定期以 0.4 %錐藍染劑(trypan blue)染 色，於顯微鏡下使用血球計數盤計數之，以控制細胞密度維持在 1~2

× 10⁵/ mL 之間；並確定其存活率大於 95 %以上。於每次不同實驗進 行之前，細胞至少先培養 2~8 天，以維持細胞生長之穩定度⁵¹。

第四節 HYL 系列衍生物對 HL-60 cells 增殖作用之影響

將 HL-60 cells (1.0 × 10⁵/ mL)培養於 24-well 之培養皿中使最後 總體積為 1 mL/ well；並加入各種不同濃度之 HYL 衍生物後，於 37

℃、溼度 95 %、5 % CO₂之培養箱中，培養固定時間之後，分別取出 作 MTT-proliferation assay 實驗。

 MTT-proliferation assay 原理：

MTT assay 是一種應用於分析細胞增生(cell proliferation)和細 胞毒性(cytotoxicity)之分析方法。分析方法是利用檢測活細胞之粒腺 體內的酵素琥珀酸鹽去氫酶(succinate dehydrogenase)活性來測定細 胞的存活狀態，進而得知相對的活細胞比例。活細胞內的琥珀酸鹽 去氫酶可與 MTT 發生氧化還原作用，而使 MTT 由淡黃色還原成紫 色結晶狀之 formazan，其反應式如下⁴²：

首先從每 well 取出 850 μL細胞液，離心後去除上清液，再加入 400 μL之 HBSS 清洗細胞，再次離心以徹底清除殘餘之培養基，再次 去除上清液，最後加入400 μL之 HBSS 並且震盪均勻後，取 50 μL 細胞液置入 96-well plate 中，加入 10 μL MTT solution於 37 ℃培養箱 中培養 4 小時。取出後加入 DMSO (150 μL/ well )溶解 formazan 鹽類，

並以 ELISA reader 於波長 570 nm 條件下測得 OD570值。

Proliferation (%) = Sample OD570 ∕Cont.OD₅₇₀ × 100 %

第五節 HYL 系列衍生物對 HL-60 cells 分化作用之影響

 NBT Reduction Assay

HL-60 cells (1.0 × 10⁵/ mL) 培養於 24-well 之培養皿使最後 1 mL / well；並分別加入各種 HYL 衍生物於 37 ℃、溼度 95 %、5 % CO2

之培養箱中，培養固定時間之後，分別取出做 NBT reduction asaay 實 驗。

硝基藍四氮唑(nitroblue tetrazolium；NBT)溶液做為誘導細胞分化 活性測試之原理在於白血病細胞若分化成熟時可恢復其吞噬功能，而 細胞內酵素活性也會大量增加並釋放出超氧化物(如：superoxide)以防 禦外來物質的侵犯。於是我們利用其還原能力將 NBT 還原成藍黑色 的 formazan 鹽纇沉著於細胞內。並於顯微鏡鏡檢 200 個左右的細胞，

計算其呈藍黑色細胞相對於總數所佔百分比即為誘導分化的比例。

首先將每 well 中取出 850 μL細胞液離心(1200 r.p.m., 5 min)後去 除上清液；再用 400 μL HBSS洗之，接著再次離心(1200 r.p.m., 5 min) 去除上清液。然後加入 50 μL NBT solution，於溫度 37 ℃的培養箱中 培養 30 分鐘；取出後至於冰上，在顯微鏡下以細胞計數盤計數其分 化細胞比率。

Differentiation (%) =

細胞質呈紫黑色的細胞總數 / 全部的細胞總數 × 100 %

 細胞形態之分析(Morphology)：

(1) 細胞形態攝影：將 HL-60 cells (1.0 × 10⁵/ mL)培養於 24-well 培養皿內，使最後體積為 1 mL/ well。每 well 中加入 1 μL之各種不 同濃度 HYL 衍生物。於 37 ℃、溼度 95 %、5 % CO2之培養箱中，培 養固定時間之後，在倒立式顯微鏡下觀察細胞形態的改變並攝影之。

(2) 細胞抹片分析：將 HL-60 cells (1.0 × 10⁵/ mL)密度培養於 24-well 之培養皿使最後 1 mL/ well；並分別加入各種 HYL 衍生物於 37 ℃、溼度 95 %、5 % CO2之培養箱中，培養固定時間之後，分別 取出作形態變化之觀察。

首先自每 well 中取出 850 μL細胞液離心(1000 r.p.m., 5 min)後去 除上清液；再以400 μL HBSS洗之，接著再次離心(1000 r.p.m., 5 min) 去除上清液。然後取5 μL細胞液滴至蓋玻片中心待製作細胞抹片，

並於室溫下待細胞抹片完全乾燥後準備染色。在已乾燥的細胞抹片上

先滴入200 μL Liu A solution 反應 10 秒鐘，接著再加入 400 μL Liu B solution 與 Liu A solution 充分混合反應 20 秒鐘；直到液面呈現金屬 光澤，即可用大量之蒸餾水將染劑沖去。將細胞抹片於室溫下蔭乾再 用封片油(cytoseal)將染色完成之抹片固定於載玻片上；最後於顯微鏡 下觀察並攝影之。

第六節 HYL 系列衍生物對 HL-60 cells 細胞週期(cell cycle) 之影響

將 HL-60 cells (1.0 × 10⁵/ mL)培養於 24-well 之培養皿使最後 1 mL / well；並分別加入各種 HYL 衍生物於 37 ℃、溼度 95 %、5 % CO2

之培養箱中，培養固定時間之後，分別取出做細胞週期分析。

首先將每 well 中取出 850 μL細胞液離心(1200 r.p.m., 5 min)後去 除上清液；再用 400 μL PBS洗之，再次離心(1200 r.p.m., 5 min)去除 上清液。將細胞團塊彈散後，再慢慢加入 70 % EtOH 固定之；置於 -20

℃冰箱中 overnight。第二天取出離心(1200 r.p.m., 5 min)去除上清液；

再用200 μL PBS洗之，再次離心(1200 r.p.m., 5 min)去除上清液；加 入 cell cycle reaction stain solution 於暗室中反應 30 分鐘。最後以流式 細胞儀(FACscan)收集細胞並分析之；細胞週期之統計則利用 ModFit 軟體處理。

第三章 實驗結果與討論

第一節 HYL 系列衍生物對 HL-60 細胞增殖的影響

將一系列 3,6-subsituted 9-pyridylmethylcarbazole (HYL)衍生物分 別加至含培養基的之 HL-60 細胞中培養 48 小時後取出以錐藍(trypan blue)染劑染色，於顯微鏡下計數測試其細胞存活率(cell viability)。當 細胞因加藥處理死亡時，細胞膜會破裂而使染劑進入細胞內讓死亡之 細胞呈現藍色；而正常存活的細胞則因細胞膜完整，將染劑阻擋在 外，故呈現透明無色。HL-60 細胞經 HYL 系列化合物處理 48 小時之 後，呈現藍色之細胞數並未超過其總量的 10 %以上，由此可知 HYL 系列化合物所致的細胞數量減少，並非因為細胞毒殺性(cytotoxicity) 而造成，故排除其具有劇毒性的疑慮。

接著再以 MTT-proliferation assay 來檢測 HYL 系列化合物對 HL-60 細胞增殖的影響。因為 MTT 染劑可穿透活細胞的細胞膜被粒 腺體上的琥珀酸鹽去氫酶還原成藍黑色 formazan，再利用 DMSO 將 formazan 溶解釋出，於 570 nm 下測量吸光值的多寡以推算其對於抑 制細胞增殖的百分比例。結果如 Table 1.以及 Fig. 3.所示

在一系列 carbazole 衍生物中，N 上未有取代基之化合物，即 HYL-1a 及 HYL-1d，並沒有顯著抑制 HL-60 細胞增殖的活性。

N-substituted 衍生物之活性明顯比 N-unsubstituted 衍生物強。其中以

HYL-5 的抑制 HL-60 細胞增殖活性較好，其 IC50為16.8 μM。3-acetyl 9-pyridylmethylcarbazole 衍生物(HYL-2b、HYL-3b、HYL-4b、

HYL-5b、HYL-6b)中則以 3-acetyl-9-(6-hydroxymethylpyridin-2-yl)

methylcarbazole (HYL-5b)的抑制 HL-60 細胞增殖活性較強，其 IC50

為8.0 μM。3,6-Diacetyl 衍生物(HYL-2c、HYL-3c、HYL-4c、HYL-5c、

HYL-6c)的溶解度皆不佳，且其 IC50 皆大於最高可溶濃度。Hydroxy-carbazole 衍生物(HYL-7、HYL-8、HYL-9)中以 HYL-9 對 HL-60 細 胞增殖之抑制活性最好(IC50 為 5.7 μM)，是全系列中最具抑制增殖活 性的化合物。

除此之外，也發現加藥處理 48 小時後，3-acetyl 9-pyridylmethyl-carbazole 衍生物(如：HYL-2b、HYL-3b、HYL-4b、HYL-5b)會使細 胞發生形態變化(細胞變狹長形且較貼附於培養皿底部)，推測這類化 合物可能具有促使 HL-60 細胞分化的能力。因此，也針對此系列的 化合物進行誘導分化的活性測試(NBT assay)。

第二節 Acetyl 基團對 HL-60 細胞分化誘導及抑制增殖活性 之影響

首先比較 HYL-2、HYL-3、HYL-4、HYL-5 與 HYL-2b、HYL-3b、

HYL-4b、HYL-5b 於加藥處理 48 小時之後的細胞分化效果(ATRA 為

positive control)，結果如 Table 2. 所示：分別加入 10 nM、20 nM、50 nM 與 100 nM ATRA 處理 48 小時之後，可明顯地觀察到其分化效果，

其數據分別為：4.1 %、10.9 %、19.0 %以及 23.7 %。HYL-2 與 HYL-2b 做比較，發現 HYL-2 沒有分化作用，但 HYL-2b 具分化效果，在 10 μM 下，分化百分比達 20.4 %，然而，濃度若提高至 40 μM，則會因 為細胞增值能力受到高度抑制(只剩 9 %)而影響其 NBT 數據之判讀。

HYL-3 與 HYL-3b 做比較，HYL-3 沒有分化能力，而 HYL-3b 具明

顯的分化效果(10 μM 下，NBT 數據高達 67.5 %)。HYL-4 與 HYL-4b 做比較，HYL-4 不具分化效果，但 HYL-4b μM 具有分化能力。HYL-5 與 HYL-5b 做比較，HYL-5 不具分化能力，而 HYL-5b 具分化能力。

綜合上述的結果發現，具有 acetyl 取代基團之分化效果明顯優於 沒有 acetyl 取代之化合物。而 HYL-3b 單獨加藥處理 48 小時，即有 明顯的誘導細胞分化表現(10 μM，67.5 %)，故為了了解 HYL-3b 對 於 HL-60 細胞產生誘導分化現象的發生時間，著者決定：

(1)以 HYL-3b 為主作時間點(time curve)的實驗，以找出其之誘導分化 效果是何時開始作用在 HL-60 細胞上。

(2)並測試 HYL-3b 合併使用 ATRA 之後，是否能夠有效地提高 ATRA 誘導分化的活性，並且以細胞週期分析來探討 HYL-3b 對於 HL-60 細胞的細胞週期影響。

第三節 合併使用 HYL-3b 與 ATRA 之誘導 HL-60 細胞分 化效果活性探討

分別將 1、5、10、15、20 μM HYL-3b 合併不同濃度(10、20、

50 nM)之 ATRA，經過 48 小時處理後，測試所增強分化效果的幅度，

結果如 Table 3. 所示。10、20、50 nM ATRA 單獨使用的分化比例依 序為 7.0 %、12.5 %以及 28.0 %。當 1 μM HYL-3b 與 10、20、50 nM ATRA 合併使用時：所得分化比例從未加 ATRA 的 0.3 % (Table 4.)依 序提高至 8.6 %、60.7 %及 73.7 %。在此條件下，最佳的組合為 1μM HYL-3b 合併 20 nM ATRA，增加的幅度為 60.4 %。當 5μM HYL-3b 與 10、20、50 nM ATRA 合併使用時：所得分化比例從未加 ATRA 的 6.0 % (Table 4.)依序提高至 55.2 %、80.5 %及 91.2 %。在 5μM HYL-3b 與 50 nM ATRA 合併使用的情況下，增加的幅度為 85.2 %，幾乎達到 完全分化的效果。當10 μM HYL-3b 與 10、20、50 nM ATRA 合併使 用時，所得分化比例從未加 ATRA 的 67.5 % (Table 4.)依序提高至 74.0

%、80.4 %及 90.9 %。因為單獨使用 10 μM HYL-3b 的分化效果即達 到 67.5 %，因此所增加分化的效果幅度有限，並不能明顯地看出兩者 之間是否具有協同作用。當15 μM HYL-3b 與 10、20、50 nM ATRA 合併使用時，由於開始出現抑制增殖的作用，因此分化比例較前一個 條件為低，其分化效果自單獨使用時的 51.8 %下降至合併使用 10 nM

ATRA 時的 45.7 %。而 20 μM HYL-3b 與 10、20、50 nM ATRA 合併 使用時，細胞數目明顯變少，推測是因為 HYL-3b 與 ATRA 兩者造 成細胞增殖抑制能力增強所致；當然也有可能是大部分的細胞已經因 為 ATRA 與 HYL-3b 誘導分化而使之進入末端分化，循正常的細胞 週期而導致死亡。