第二章、 研究方法
第二節 研究設計
一、 大鼠腎臟纖維化模式
單側輸尿管阻塞手術之方法是依據文獻來進行19, 55-56, 60，首先以 腹腔注射pentobarbitol 方式完成麻醉，隨後在腹部中線左側劃開皮膚 組織及皮下肌肉層。然後將左側腎臟暴露出來，隨即辨認並分離出輸 尿管。輸尿管結紮的動作是在輸尿管距離腎臟約一公分處以4-0絲線 作上端結紮，接下來在往下約一公分處再以4-0絲線進行下端結紮。
然後在上、下端結紮處之間以剪刀將輸尿管剪斷。在確認無出血或漏 尿情形之後，再逐步將腹部皮下肌肉層傷口與皮膚組織傷口縫合。至 於假性手術組的對照鼠，也是同樣接受腹部皮膚組織及皮下肌肉層剖 開術，並且按照前述方法分離出左側輸尿管，但是並未真正實施結紮 和剪斷輸尿管的動作，隨後也是在確認無出血或漏尿情形下，將腹部 皮下肌肉層傷口與皮膚組織傷口逐步縫合。
二、 實驗之分組與進行
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Aliskiren, valsartan 或合併治療對於單側輸尿管阻塞(UUO)誘發的 腎臟纖維化之療效，分別是在 UUO 後第七天和第十四天做評估。在 這兩個不同天數的大分組中，又細分有五個小組，分別是：
（一） 假性手術＋安慰劑：此組共有五隻大鼠，只接受假性手 術，未進行結紮輸尿管，也以安慰劑（PBS）餵食。
（二） UUO＋安慰劑：此組共有五隻大鼠，有接受單側輸尿管 結紮，但只餵食安慰劑（PBS）。
（三） UUO＋valsartan , 30 mg/kg/day：此組共五隻大鼠，有接 受單側輸尿管結紮，並每天餵食valsartan, 30 mg/kg。
（四） UUO＋aliskiren：此組共有五隻大鼠，有接受單側輸尿管 結紮，並每天餵食aliskiren, 20 mg/kg。
（五） UUO＋Aliskiren +valsartan 合併治療：此組共五隻大鼠，
有接受單側輸尿管結紮，並每天餵食 valsartan, 15 mg/kg 及 aliskiren, 10mg/kg。
所有的大鼠在UUO 後第七天或第十四天先經由麻醉犧牲，再抽血以 檢測血漿腎素活性並取腎臟組織進一步檢驗。
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三、 腎 臟 病 理 組 織 切 片 及 免 疫 組 織 化 學 特 殊 染 色 分 析
(Histopathological and immunohistochemical analysis)
每隻大鼠兩側腎臟組織經過固定及包埋之後，就依照一般例行的 病理切片步驟，製作成四毫米厚之切片，經過脫臘手續之後，就進行 H＆E 染色及封片。整個腎臟橫切面圖先以掃瞄方式記錄，最後在顯 微鏡下進行判讀。我們採用一種依照先前文獻記載的標準點計算方式 (Point counting method)來評估腎臟組織的顯微變化 57。這種方法是在 四百倍放大的視野下，利用 10×10 的格子在圖像上形成一百個採樣 值，再轉換成的百分比數字。腎間質體積分數(score of interstitial volume)的計算方法，則是計算每一個四百倍放大圖樣下，標準格子 點落在腎間質區域的總和，再取二十個非重疊圖像的分數平均值，最 後轉換成百分比數字即可，後面文章中會提及之α-SMA 分數或膠原
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蛋白分數也都是應用上述的標準格子點計算方式即可。
如前所述，腎臟組織切片在脫臘後，先在磷酸鹽緩衝液（0.1mM phosphste buffer solution, PH7.2, PBS）清洗三次，每次十分鐘，然後 置於3％雙氧水溶液中 10 分鐘，再以 PBS 洗 3 次。取出切片後，將 組織周圍的水份以無塵拭紙吸乾，置於保濕盤中，在組織上滴滿 10
％的正常山羊或兔子血清，於室溫 30 分鐘，倒掉血清，在組織上滴 滿一級單株抗體，置於 37℃，4 小時或隔夜，再以 PBS 洗 3 次，在 組織上滴滿次級抗體（biotinlated seconday antibody, DAKO ChemMate detection kits），於室溫 10 分鐘，以 PBS 洗 3 次，在組織上滴滿受 質（peroxidase conjuqated streqtavidin, DAKO ChemMate detection kite），置於室溫 10 分鐘，以 PBS 洗 3 次，再用蒸餾水洗去鹽類，
在組織上滴滿呈色劑（AEC or DAB substrate, DAKO ChemMate detection kits），於室溫 5 分鐘，用蒸餾水洗淨。滴上蘇木精複染數 秒，然後水洗，滴上封片膠，蓋上蓋玻片，置於顯微鏡下鏡檢。本研 究 所 使 用 的 一 級 抗 體 包 括 ：α-smooth muscle actin 抗體(α-SMA, 1:200 dilution, Epos system, Dako, California, USA）、TGF-β1 抗體 (rabbit anti-human TGF-β1, 1:50 dilution, Santa Cruz Biotechnology）和 ED-1 抗體（rabbit polyclonal antibody against ED-1, 1:200；seoofec.
Oxford UK）。ED-1 抗體主要是染單核細胞及巨噬細胞。鏡檢時，又
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再以前述的標準點計算方法，換算出每一個腎臟的α-SMA 染色積分 (Score of α-SMA)。ED1 染色陽性的細胞積分(Score of anti-ED1 positive cell)則是直接計算二十個 400 倍放大影像中 ED1 染色陽性 的細胞總數，最後再取平均值即可56。
我們利用實驗室曾經發表過的染色方法，Sirius staining 來評估腎 間質膠原蛋白的堆積程度 61-62。這種染色法的原理是利用 sirus red F3BA 對於所有膠原蛋白的選擇性結合以及 fast green FCF 對於非膠 原蛋白的蛋白質之特殊結合作用。膠原蛋白會呈現暗紅色，而非膠原 蛋 白 則 呈 現 蘋 果 綠 染 色 。 腎 間 質 膠 原 蛋 白 的 堆 積 分 數(score of interstitial collagen deposition)也是利用上述的標準取樣點計算方式來 評分60-63。
四、 膠原蛋白總量之分析
至於膠原蛋白的總量是以 sirius staining 的特殊結合原理來檢測，
我們將脫臘後的病理切片分別以sirius red F3BA 及 fast green FCF 染 色後，利用sodium hydroxide-methanol 洗提出整塊切片組織的所有蛋 白質，最後分別利用 540nm 和 605nm 吸收光譜來決定 sirius red F3BA 和 Fast green FCF 結合的蛋白總量，這個吸光值提供了測定膠
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原蛋白佔所有蛋白質總量的比例值，因此膠原蛋白的總量最後就是以 每毫克總蛋白中膠原蛋白佔多少微克(μg/mg)來表示。因為這是一個 相對值，所以和組織切片的厚度無關。
五、 西方墨點分析
我們採用西方墨點分析法來檢測大鼠腎臟組織中的第四型膠原蛋白 (Type IV collagen) ， α-SMA 蛋 白 和 ERK 1/2 (extracellular signal-regulated kinase 1/2)的表現 64-66。腎臟組織樣本先經過秤重後，
加入蛋白質萃取試劑萃取其蛋白質（T-PER Pierce Biotechnology. IL, USA），再以研磨機將組織液研磨成均質乳劑；經過離心及 PBS 清 洗後，溶入一毫升的消化緩衝液，然後置於冰浴中三十分鐘。隨後取 出細胞分解液20 微克，混合等量的 2X SDS 裝載樣本緩衝液（loading buffer, 125Mm Tris-Hcl, 4% SDS, 20% Glycerol 100mM DTT, 及 0.2％ bromophenol blue），再加熱到 100℃五分鐘後即可準備跑膠。
完成架設電泳膠片(10% SDS-polyacrylamidegels)後，就可以將電泳緩 衝液加入電泳槽內。將待測樣本及對照樣本分別加在電泳膠片孔內以 200 伏特電泳約三十至四十五分鐘。隨即將電泳膠片取出，然後再以 濕式轉漬器來進行轉漬(transfer)至 PVDF 膜上，於 4℃150 伏特 1 小
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時。然後取出 PVDF 膜進行染色和標示標記分子的大小，然後再以 PBS-T 清洗脫色。隨後加入稀釋的α-SMA 抗體(Dako, CA, USA), 或 actin 抗體(Santa Cruz, CA, USA)等次級抗體。再於室溫下置於震盪器 上反應一小時。之後將膜浸泡於緩衝液中震盪五分鐘，然後將膜上的 水分吸乾，置於透明保護膜內，於暗房中放入 X 光底片上壓片，最 後再沖洗底片觀察結果。所有蛋白質的表現量都經過定量，並且用 β-actin 蛋白表現量來校正。
六、 反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcriptase-polymerase chain
reaction)
RNA 是由使用 TRIzol reagent (Invitrogen, Carsbad, CA, USA)處理腎
臟組織而取得，並經由260 nm 的紫外線吸光值來定量。首先 c-DNA 的合成是使用2 μg RNA 於 20 μl 緩衝液，使用 AMV-RT (Promega, Madison, WI, USA) 及隨機的引子（random primers）來反轉錄。PCR 是使用標準的 PCR kit 以 1 μl aliquots of cDNA， HotStarTaq polymerase (Qiagen, Valencia, CA, USA) 及基因特異的引子。我們 所利用的引子(primer)在 Snail-1 是: 5’-CAC TAT GCC GCG CTC19
TTT C-3’ (sense) and 5’-GGT CGT AGG GCT GCT GGA A-3’
(antisense)。TGF-β1 的引子是： 5’-CCT GAG TGG CTG TCT TTT GAC G-3’ (sense) and 5’-AGT GAG CGC TGA ATC GAA AGC-3’(antisense); β–actin 的引子則是： 5’-CAG CTG AGA GGG AAA TCG TG-3’ (sense) and 5’-CGT TGC CAA TAG TGA TGA CC-3’
(antisense)。Snail-1 蛋白可以藉由扮演轉錄抑制因子的主要角色來促 進EMT 的發生，因此 Snail-1 蛋白被認為在 EMT 中扮演最重要的角 色。