硫鐵蛋白

光合作用 (photosynthesis)、胺基酸合成 (amino acid synthesis)、過氧化物代謝 (reactive oxygen species metabolism)、植物生長代謝 (plant-growing metabolism)

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等 (Hanke et al. 2004; Zurbriggen et al. 2008)。這些反應會影響植物的生長、發育、

能量儲存、對抗環境逆境及病原菌入侵等反應 (Tognetti et al. 2007)。

(一) 硫鐵蛋白的分類

過去研究顯示，在模式植物阿拉伯芥上擁有 8 種不同的硫鐵蛋白序列，分 別為 AtFd1、AtFd2、AtFd3、AtFd4、AtFd1 mi、AtFd2 mi、FdC1 與 FdC2，依 照功能與分佈位置可分為五大類 (Hanke et al., 2004; Voss et al. 2011；Grinberg et al., 2000)。

第一類為光合作用型硫鐵蛋白 (photosynthetic-type Fd, PT-Fd) 或稱葉部型 硫鐵蛋白 (Leaf-type Fd, LT-Fd)，存在於綠色組織中，包含 AtFd1 與 AtFd2。

第二類為非光合作用型硫鐵蛋白 (non-photosynthetic type ferredoxin, nPT-Fd) 或稱根部型硫鐵蛋白 (root-type Fd)，存在於儲存性組織 (Hanke et al., 2004)。

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分布則概分成兩大類，第一類為植物類硫鐵蛋白 (plant ferredoxin-like protein, PFLP)，主要存在於葉部及莖部的綠色組織中，屬於 PT-Fd (Dayakar et al. 2003)。

另一類為 Fd, root R-B1 以及 Fd, root R-B2，此類 Fd 未有正式報告證明其功能 環式電子傳遞路徑 (cyclic electron flow, CEF)，藉此將更多葉綠囊外的氫離子帶 進葉綠囊基質內部，再利用 ATPase 將氫離子重新打出膜外，利用此反應藉以

7 鐵蛋白 (plant ferredoxin like protein, PFLP) 大量表現在幾種不同的作物上，並證 明這些轉基因作物能有效的提升對於病原菌及非生物性逆境的耐受性。例如在基 因轉殖水稻中增量表現 PFLP，可以提升其對於水稻白葉枯病原菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 所引起的白葉枯病之抗病能力 (Tang et al. 2001)；在基因轉殖的 蘭花、彩色海芋、青花菜、煙草、阿拉伯芥等植物增量表現 PFLP，也可以提升 這些基因轉殖作物對於軟腐病菌 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum 所引起的病害之抵抗能力。在維管束病害方面，增量表現 PF-Fd 在基因轉殖番 茄及阿拉伯芥，均可有效提升這些基因轉殖植物對於 Ralstonia solanacearum 所 引起青枯病的抗病能力，以及在基因轉殖香蕉上增量表現 PFLP，可以提升其對 於 X. campestris pv. musacearum 引起的細菌性萎凋病的抗病能力 (Liau et al.

2003; Huang, Ger, et al. 2007; Huang, Liu, et al. 2007; Lin et al. 2010; Namukwaya et al. 2012)。另外，PT-Fd 在植物面臨非生物性逆境時也扮演著重要的角色。研究

8 生物時，例如：枯草桿菌屬 (Bacillus. spp)、某些假單孢桿菌屬 (Pseudomonas.

spp) 以及某些木黴菌屬 (Trichoderma. spp) 真菌時，可以啟動植物 SA 以

subtilis 可以幫助阿拉伯芥抵抗細菌性軟腐病菌 P. carotovorum (Choudhary, Prakash, and Johri 2007)、B.subtilis 可以幫助瓜科植物產生 callose、木質素 (lignin) 與大量累積 H2O2 以抵抗 Podosphaera fusca 的感染 (Romero et al.

2007; Garcia-Gutierrez et al. 2013) P. fluorescens 及 T. harzianum 可以提升 水稻對於 R. solani 的抗性反應，以抵抗此病菌在水稻所引起的紋枯病 (Singh et al. 2016)。B. cereus AR156 的胞外多醣可以誘導阿拉伯芥的 ISR

9 物促生土壤菌 (plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)，實際案例有：

B. cereus TSH77 能產生 IAA，促進薑黃莖部生長情況 (Chauhan et al. 2016)。

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cysteine rich peptides (NCRs) 的 氧 化 還 原 ， 進 一 步 影 響 苜 蓿 根 瘤 菌 Sinorhizobium meliloti 的共生現象 (Ribeiro et al. 2017)。這樣的現象告訴我 們，植物會利用調控自身的氧化還原蛋白來控制生活周遭微生物族群，以 達到更適合生存在此環境的目的。而在微生物影響植物光合作用相關蛋白 表現量的案例也有研究指出，當植物處理一種促進植物生長的真菌 (plant growth promoting fungi, PGPF) 木黴菌 T. longibrachiatum MK1 之後，可以 促進植物光合作用相關蛋白如：葉綠素 a / b 結合蛋白 (Chlorophyll a/b binding protein) 以及原葉綠素還原酶 (Protochlorophyllide reductase) 的增 量表現，以幫助植物生長發育 (De Palma et al. 2016)。而類似的情況也在植 物另一個氧化還原蛋白 Fd 中發現，研究顯示：植物受到病菌感染時，會 改變自身體內 Fd 的含量來對抗病菌的入侵。例如植物被感染了軟腐細菌 P.

carotovorum subsp. carotovorum 後，其體內之 PT-Fd 含量會明顯減少，但 是 如 果 接 種 不 能 感 染 該 植 物 的 豆 科 細 菌 性 班 點 病 菌 (P. syringae pv. Khan 2008; Barriuso, Solano, and Gutierrez Manero 2008; Boro et al. 2004; Joo et al. 2005; Pal et al. 2001; Peralta et al. 2012; Rudrappa et al. 2007; Ryu et al.

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2003; Ryu et al. 2007; Yan, Reddy, and Kloepper 2003)。其中在幫助植物抵抗 病原菌的部分則是以拮抗病原菌生長作用 (antibiosis) 以及 ISR 為主。研 究指出，由芽孢桿菌所產生的抗生物質大約有 169 種以上 (Katz and Demain 1977)，化合物如脂胜肽類 (lipopeptides) 有： surfactin、fengcin 和 iturin；聚酮化合物 (polyketides) 有：macrolactin 和 bacillaene，可用來抑 制 Beauveria bassiana 的孢子發芽及菌絲生長。由 B. thuringiensis 所產生 的幾丁質酶 (chitinase) 可以抑制 F. oxysporum 以及 R. solani 的生長 (Mehmood et al. 2015)。由 B.cereus 所產生的環狀二肽 (Cyclic dipeptides, CDPs) 具有抑制線蟲生長的能力 (Kumar, Nambisan, and Mohandas 2014)。

另外，有研究報告指出芽孢桿菌會分泌氰化氫 (HCN)、啡并 (phenazines)、

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目，鞘翅目和雙翅目 (Jouzani et al. 2008; Salehi Jouzani et al. 2008)。

有 研 究 指出 B. thuringiensis 具 有用 作 控制植 物 的 殺線 蟲 劑 使 用 (Iatsenko, Boichenko, and Sommer 2014; Iatsenko et al. 2014; Salehi Jouzani et al. 2008)。而在近年的研究指出，蘇力菌除了具有殺昆蟲的 功能外，亦具有直接抑制微生物生長的潛力，例如：蘇力菌會分泌細 菌素 (Bacteriocins) 抑制真菌的生長 (Salazar-Marroquin et al. 2016)。

因此在過去田間使用上，蘇力菌作為一種有效的殺蟲菌種而被大量使 用，根據統計，在 1938 年法國出現第一個蘇力菌產品，至今全世界 蘇力菌產品超過 100 種以上，佔生物農藥販售量 90% 以上，由此可 知蘇力菌對於田間病害的防治具非常良好的效果。

蘇力菌除了抗蟲之外，近期的研究證實了更多 B. thuringiensis 不 同的潛力。包括促進植物生長(Armada et al. 2016; Armada et al. 2015)，

協助植物修復由病原菌、重金屬以及其他化學物質所造成的傷害 (El-Helow, Sabry, and Amer 2000; Mendil et al. 2008; Tuzen, Melek, and Soylak 2008; Fang et al. 2010; Babu, Kim, and Oh 2013)，拮抗動物及植 物病原菌等功能 (Benz and Graf 1971; Dong et al. 2004; Garbutt et al.

2011; Lemes et al. 2014; Mehmood et al. 2015)。

(2) 仙人掌桿菌 (B. cereus, Bc)

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在自然環境下，仙人掌桿菌可以分泌抑菌素 Zwittermicin A 直接

抑制卵菌綱病原菌的孢子管生長，也可以釋放 NH3、鈣離子螯合劑以

及提升環境 pH 值以抑制真菌性病原菌之遊走孢子發育 (Rogers, Dalisay, and Molinski 2010; Emmert et al. 2004; Milner, Stohl, and Handelsman 1996; Stabb, Jacobson, and Handelsman 1994; Silo-Suh et al.

1994)。 力 (Zhao et al. 2011; Halverson and Handelsman 1991)。在作為生物防 治菌種方面，仙人掌桿菌可以增加植物對於病原菌的抵抗能力 (Nie et al. 2017; Jiang et al. 2016; Janahiraman et al. 2016; Rosenkvist and Hansen 1995; Halverson, Clayton, and Handelsman 1993)。

(3) 枯草桿菌 (B. subtilis, Bs)

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2006)，可用來防治真菌性病原菌如：Cercospora kikuchii、V. dahliae、

F. oxysporum f. sp. lycopersici、A. mali、R. solani 和 P. oryzae，與細 菌性病原菌如：X. oryzae、P. lachrymans 以及 R. solanacearum 等多 種植物病原菌 (Katz and Demain 1977)。

而枯草桿菌在實際應用上面可以幫助植物啟動 ISR 以抵抗許多病 原菌 (Pretali et al. 2016; Cawoy et al. 2014; Garcia-Gutierrez et al. 2013)。

除了直接在田間施用，枯草桿菌也可以直接將作物種子進行拌種處理， Leelasuphakul, and McCollum 2014)，幫助菸草抵抗由 Cercospora 所 造成的白星病 (Maketon, Apisitsantikul, and Siriraweekul 2008)、由 X.

axonopodis pv. vesicatoria 在茄科作物所引起的細菌性葉斑病 (Lee, Lee, and Ryu 2012; Etchegaray et al. 2008)；由 X. campestris 在芒果及 葫蘆所引起的細菌性黑斑病 (Zeriouh et al. 2011; Sripreechasak et al.

2013)；以及由 S. rolfsii 在山蘇、蟲草與山藥等作物造成的白絹病 (Ramzan et al. 2016; Janahiraman et al. 2016; Tiwari et al. 2010; Ghai, Sood, and Jain 2007)；由 C. gloeosporioides 在多種作物引起的炭疽病 (Kim, Balaraju, and Jeon 2016; Ashwini and Srividya 2014; Kim et al.

2010) 等病害皆有良好的防治效果。

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Liu et al. 2011; Arrebola, Jacobs, and Korsten 2010; Tzeng et al. 2008)。

在協助植物抵抗病原菌部分，由液化澱粉芽孢桿菌所產生的 iturin 及 surfactin 可以同時啟動植物由 SA 及 JA 所介導的兩條抗性路徑，

以抵抗不同病原菌的侵害 (Wang, Liu, et al. 2016; Rahman, Uddin, and Wenner 2015; Kloepper, Ryu, and Zhang 2004; Ahn, Park, and Kim 2002)。

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液化澱粉芽孢桿菌也可以提升植物抗性以抵抗病原菌或是昆蟲的攻 擊 (Tahir et al. 2017; Li et al. 2016; Krober et al. 2016; Aziz et al. 2016;

Shternshis et al. 2015; Li et al. 2015; Lee et al. 2015; Kang, Radhakrishnan, and Lee 2015; Cawoy et al. 2014)。

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第二章、實驗動機

基因轉殖技術的蓬勃發展造就了科學研究的進步以及造福人類許多生活所 需，如增加食物的營養以解決營養缺乏的問題，或是增加作物的抗病能力以減少 因為病害所造成的損失。不過也因為基因轉殖技術帶來太多對於生態的穩定或是 人體的健康不確定性，導致許多人不能接受基因轉殖，甚至抗拒轉基因食品。而 在過去的研究顯示 PT-Fd 為一群可調控基礎代謝路徑相關酵素活性的氧化還原 蛋白。利用基因工程的技術增量表現 PT-Fd 可以有效提升植株對於逆境及病原 菌的抵抗能力。利用根圈有益微生物對於植物光合作用相關蛋白的的影響研究卻 甚稀少，本實驗便想利用植物根圈有益微生物改變植物光合作用相關蛋白表現，

並達到協助植物抵抗生物性及非生物性逆境的作用。故本實驗目的便是希望得到 數隻可誘導辣椒及番茄體內光合作用型硫鐵蛋白含量的根圈細菌，並且能幫助植 物抵抗青枯病及高溫高能逆境。

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19 Bio-Rad protein assay buffer，利用 Whatman No.1 濾紙過濾。準備 0、2、5、

10 及 20 μg /μL 的小牛血清蛋白溶液作為標準蛋白溶液。各取 10 μL 不同

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濃度的標準蛋白溶液或待偵測蛋白質溶液，分別與 190 μL 無菌水及 800 微 升的染色試劑溶液均勻混合，靜置反應 7 分鐘，取出混合液偵測吸光值 ( A595 )。把標準蛋白溶液的吸光值對蛋白質濃度作圖，計算出回歸直線公式，

再將待偵測蛋白質溶液的吸光值代入，以內插法算出其蛋白質溶液濃度。

(二)、 聚丙烯醯胺膠體電泳 ( sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE ) 水及 2μL 的四甲基二乙胺 ( N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine, TEMED ) 混合成 5 mL 的分離膠體溶液。將此溶液注入鑄膠槽中，並在膠體上覆蓋少 15 分鐘，冷卻後快速離心，然後將樣本混合液與 prestained protein marker 分別注入樣本槽中。通以 80 伏特的電壓 30 分鐘，再提升電壓至 120 伏 特，待 marker 中 18 kDa 到達膠體長度的三分之二位置，關閉電源。取出 膠體可供考馬斯亮藍染劑染色或西方墨點法之使用。

(三)、 膠體考馬斯亮藍染色

將 SDS-PAGE 電泳膠片浸泡於考馬斯亮藍染劑 (水：甲醇：醋酸=500

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mL：400 mL：100 mL)，含 250 mg Coomassie Brilliant Blue R-250) 中四小 時。改變為考馬斯亮藍染劑退染劑 (水：甲醇：醋酸=500：400：100)，浸

先準備磷酸鹽緩衝生理鹽水 (phosphate buffer saline, PBS) (137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4)，PBS-Tween 20 ( PBST ) 緩衝液，1% blocking reagent 緩衝液。將已轉印蛋白的轉印膜平貼於雜交管內部，加入 5mL 1 % blocking reagent 緩衝液並搖晃 60 分鐘後倒掉，將一次抗體 ( polyclone antiserum

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against PFLP ) 以 15,000 倍稀釋於 3 mL 1 % blocking reagent，稀釋後將此 溶液加入雜交管中，並放入雜交箱中，以每分鐘 30 轉雜交 1 小時。以 5 mL PBST 緩衝液清洗 3 次，分別在雜交箱中轉 5, 10 及 15 分鐘。將二次抗 體 ( peroxidase conjugated affinity purified anti-rabbit IgG [Goat] ) 以 12,000 倍稀釋於 3 mL 1 % Blocking reagent，稀釋後將此溶液加入雜交管中，並放 入雜交箱中，以每分鐘 30 轉雜交 1 小時。以 5 mL PBST 緩衝液清洗 3 次，分別在雜交箱中轉 5, 10 及 15 分鐘。選用 western lighting

chemiluminescence reagen plus 使 horseradish peroxidase ( HRP ) 酵素呈色 1 分鐘，利用冷光壓片的方式偵測蛋白質呈色結果。

三、 基因表現量分析

三、 基因表現量分析