在細胞實驗確實可證實氯化鎘(CdCl2)可以造成胰臟胰島beta細胞功能損 傷。因此，我們進一步利用動物實驗去確認細胞實驗結果。雄性ICR鼷鼠給予暴 露氯化鎘(CdCl2)10 mg/kg/day 1、2、4與6週去觀察血漿中胰島素(plasma insulin) 分泌量(figure 20)，另一實驗則是給予雄性鼷鼠口服氯化鎘(CdCl2)10mg/kg/day六 週後，進行口服葡萄糖耐受性測試(OGTT)(figure 21)。由動物實驗證實氯化鎘 (CdCl2)隨時間增加確實會造成血漿中胰島素(plasma insulin)分泌降低與造成實驗 鼷鼠葡萄糖不耐受性(glucose intolerance)的增加。
. 第肆章 討論
(Adachi et al.,2007; Rikans and Yamono, 2000; Yamanaka et al., 1998)。在鎘污染的 地區，當地的居民因為長期暴露在鎘的環境下，患者的肝臟、腎臟及呼吸系統皆 出現了衰竭、受損的情形 (Akesson et al.,2005)。此外，鎘也會影響體內鈣離子的 再吸收，導致骨中鈣質流失，因此使得病人骨骼變脆容易斷裂、容易變型且疼痛 難耐(即所謂的「痛痛病」(Itai-Itai disease))(Hagino et al., 1961; Inaba et al., 2005;Staessen et al., 1999)。而台灣則是近幾年來在彰化地區所發生的鎘米事件，乃是 塑膠穩定劑工廠排放廢水至灌溉渠道污染農民用來灌溉農田所使用的灌溉水所 致(謝慶芳, 1990)。
在先前的研究報告已指出，鎘會蓄積在胰臟中並且使實驗動物血糖調控不正 常、降低血清中胰島素及肝臟中肝糖(glycogen)的含量等糖尿病相關的病徵出現 (Bell et al., 1990; Merali and Singhal, 1980)。同時，也有研究指出：長期在精煉工 廠工作的工人，其血糖濃度較一般正常人高出許多且血漿中胰島素的含量也較正 常人來的低 (Lei et al., 2006)，而產生糖尿病機率也高。糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)是一種身體對於糖類代謝功能不正常而導致血糖過高的疾病，一般分為兩種 型態：第一型糖尿病，又稱為胰島素依賴型糖尿病(Insulin-dependent DM)；第二 型糖尿病，又稱為胰島素非依賴型糖尿病(Insulin-independent DM)。不論是哪一 類型的糖尿病，都會造成患者身體血糖調控的不正常，對葡萄糖的不耐受性增
加，長時間的影響下，會導致身體併發其他許多慢性疾病的產生。但從近幾年來 的研究發現：工業化所造成的毒性重金屬污染物為誘發糖尿病發生的重要因素之 ㄧ。舉例來說，流行病學的研究已指出砷(Arsenic, As)與第二型糖尿病的發生有 很大的關連性(Tseng et al., 2000)；處理低劑量的汞(Mercury, Hg)也是可能誘發糖 尿病的重要因素之ㄧ(Chen et al., 2006)。不過近年來在動物實驗中也發現，鎘會 經由食物鏈蓄積而進入到哺乳動物體內，在胰臟中累積而使動物產生糖尿病的徵 狀(Merali and Singhal, 1980)；有研究報導指出在暴露重金屬鎘的環境下較易罹患 胰臟癌，胰臟癌與第二型糖尿病也已被發現有所關聯(Everhart et al., 1995;
Schwartz and Reis, 2000)。此外，目前也有一些流行病學的研究結果指出:根據統 計，空腹血糖異常患者(impaired fasting glucose)及糖尿病患者尿液中鎘濃度較正 常人高(Schwartz et al., 2003)；而鎘會干擾葡萄糖的代謝平衡，使血液中的血糖濃 度上升，造成高血糖症(hyperglycemia)，進而提高引發糖尿病發生的機率(Han et al., 2003)，可得知鎘會造成胰臟胰島beta細胞功能破壞而導致死亡。死亡有分兩 種一種是凋亡(apoptosis)，另一種是壞死(necrosis)。所以為了分別細胞是凋亡 (apoptosis)還是壞死(necrosis)，選擇了三種實驗方法來證實經由凋亡(apoptosis) 分別是利用流式細胞儀(Flow cytometry)去觀察Sub-G1期細胞週期(figure 6 )、
Annexin V去觀察當細胞進行凋亡(apoptosis)時細胞內磷脂絲氨酸
(phosphatidylserine ;PS)從細胞膜內外翻至細胞膜外，但壞死(necrosis)並不會 (figure 7 )，最後以Hoechst 33258在螢光顯微鏡(fluorescence microscopy)下觀察染 劑亮度增加(figure 8 )。以上三種實驗均可證實經由凋亡(apoptosis)。
細胞凋亡路徑一種為經由粒線體膜電位不平衡而引發下游一些蛋白質引起 凋亡的內在路徑，另一種則是經外在路徑由細胞膜上的死亡訊息傳遞，進而導致 細胞走向凋亡。粒線體在細胞凋亡調控中扮演了很重要的角色，有學者發現細胞 在進行凋亡前，粒線體膜電位會發生改變，導致膜上一種MPTP(mitochondrial permeability transition pore)的巨大通道打開，膜電位不平衡而調控這些粒線體的
物質釋放，所以利用了DiOC6是一種可穿透細胞膜，可專一性的結合並累積在細
活化caspase與DNA傷害 (Inoue et al., 2004; Le Bras et al., 2005)誘使cytochrome c 從粒線體釋放於細胞質與活化caspases, p53(Ueda et al., 2002)。已經有許多證實胰 臟胰島細胞b-細胞可能與暴露氧化壓力造成ROS攻擊有關(Kajimoto and Kaneto, 2004)，因為給予抗氧化酵素如catalase和glutathione peroxidase有明顯使ROS表現 降低(Tiedge et al., 1997)。我們首先觀察活性氧化物質(ROS)對人胰臟胰島beta細 胞功能，由於細胞內的GSH可保護細胞免於活性氧物質對細胞造成的氧化傷害，
而產生毒性的自由基(Free radicals)代謝的功能，一旦細胞內的GSH減少，將會造 成使細胞暴露於氧化壓力下，而導致細胞內活性氧化物質大量產生，最後引起細 胞DNA受損而死亡，已經有許多證實ROS可以造成氧化壓力與影響多種生理和 病理過程(Inoue et al., 2004)。當氯化鎘(CdCl2)刺激胰臟胰島beta細胞造成氧化物 質上升與受大量的鈣離子釋放出來及膜的通透性改變時，導致粒線體膜電位下 降，促使許多粒線體內的物質釋放出來至細胞質當中，其中包括許多促凋亡的蛋 白質釋放，例如：(1)cytochrome c、 (2)caspase、 (3)AIF、 (4)Endo G、
(5)Smac/DIABLO等，這些蛋白質可直接或間接促使細胞產生凋亡之情形以誘導 下游一連串caspase的反應因而走向凋亡，並且Kajimoto和Kaneto已經進一步觀察 到胰臟胰島beta-細胞功能破壞造成糖尿病之原因包含了氧化壓力與隨後引起活 化的c-Jun N-terminal kinase (JNK)路徑(Kajimoto and Kaneto, 2004)。
但是ROS 與 mitogen-activated protein (MAP) kinases 兩者之間關係尚未清 楚，而在我們研究發現到利用MTT assay 證實氯化鎘(CdCl2)可以誘導胰臟胰島 beta-細胞死亡(figure 1)導致功能破壞與利用流式細胞儀(Flow cytometry)去觀察 細胞凋亡透過ROS 調控粒線體依賴性細胞死亡路徑(figure 9)包含用 Isulin ELISA 看到氯化鎘(CdCl2)抑制胰島素分泌(figure 2)、誘導細胞死亡、增加脂質過氧化層 次(figure 10)、活化 mitogen-activated protein (MAP) kinases 中 JNK、ERK 與 p38 磷酸化，但唯有mitogen-activated protein (MAP) kinases 中 JNK 會去調控氯化鎘 (CdCl2)對胰臟胰島 beta-細胞死亡，其他並不會影響 (figure 3)，在於粒線體會經 由Bcl-2 調控，利用 real-time PCR 去觀看 Bcl-2 mRNA 表現與當 DNA 受到傷害 時會活化p53 磷酸化與 Mdm2 去磷酸化(figure 20)。由於凋亡(apoptosis)會造成膜 電位去極化導致粒線體膜通透性增加使釋放cytochrome c 從粒線體裡移至細胞 質，所以利用RIN-m5F 細胞給予氯化鎘(CdCl2)結果確實發現到粒線體膜電位去 極化以致於粒線體膜通透性增加使釋放cytochrome c 從粒線體裡移至細胞質、下 游活化poly(ADP-ribose) polymerase(PARP )蛋白質(figure 14)降解 caspase 3 蛋白 酶(figure 15)。
而給予N-acetyl-L-cysteine(NAC)抗氧化劑或是 JNK 抑制劑(SP600125)可以 抑制氯化鎘(CdCl2)造成細胞凋亡，由我實驗之前結果發現到是 mitogen-activated protein (MAP) kinases 中唯有 JNK 磷酸化才可以藉由氯化鎘(CdCl2)去誘導胰臟胰 島beta-細胞凋亡，而我們實驗也證實 ROS 也會造成胰臟胰島 beta-細胞凋亡，給 予氯化鎘(CdCl2)也可以誘導 ROS 產生，至於 ROS 與 JNK 有何關聯可以從我們 實驗利用流式細胞儀(Flow cytometry)發現到是 ROS 去調控下游 JNK 磷酸化造成 胰臟胰島beta-細胞凋亡(figure 19)。總結，我們可以推斷出環境中含有暴露氯化 鎘(CdCl2)污染可能是造成糖尿病重要風險因子會導致 ROS 產生去造成 JNK 磷酸 化去調控凋亡(apoptosis)中之粒線體路徑(figure 23)，最後造成胰臟胰島 beta-細胞 凋亡而無法分泌胰島素(insulin)。