細胞株 mRNA 的抽取、定量及 RT-PCR 方法同方法三中 GAS7 基因mRNA 分析。
(三) 細胞免疫染色 (Immunocytochemical analysis, ICC)
將細胞種於 6-cm 培養基上操作以下步驟。移除培養液以 1x PBS 沖洗兩次，利用冰甲醇於 -20℃ 固定 20 分鐘，移除甲醇並放 於室溫下讓甲醇完全揮發乾燥。接著於室溫下利用 PBS-T (1x PBS, 0.1% tween-20) 復水 10 分鐘兩次，移除 PBS-T，用油性色筆 (Daco pan) 圈選適當的區域。以一級抗體，GAS7 (1：100，Ab-cam) 於37℃
下作用 1 小時，再以 PBS-T 沖洗兩次，每次 5 分鐘。之後以二級 抗體 anti-rabbit (1：200，Chemicon) 於 37℃ 下避光作用 30 分鐘。
染二級抗體的同時可加入 DAPI 染細胞核。以 PBS-T 沖洗兩次，每 次 5 分鐘。利用螢光顯微鏡觀察結果並拍照。
七、統計分析
以分析的結果將病人區分為變異組與正常組，利用 Pearson χ2
test，分析 92 個肺癌病人其 GAS7 啟動子過度甲基化、mRNA 之表現 情形及蛋白異常表現與各種病理分類 (包含性別、癌症種類、癌症分 期、抽煙狀況) 關係的統計分析；其中癌症分期之 Stage I、II 定義為 較早期的病人族群，Stage III、IV 定義為較晚期的病人族群；而抽煙 狀況則分為有抽煙和沒抽煙兩個族群，有抽煙者包含目前仍在抽煙 和巳戒煙者，所有分析作業均以SPSS (11.0 版) 軟體進行。
陸、結果
一、探討肺細胞株 GAS7 基因 mRNA/蛋白的表現情形
(一) GAS7 基因 mRNA/蛋白在各種不同肺細胞株內的表現情形 在 NCBI 網站上搜尋到的資料顯示，GAS7 基因經過選擇性剪接 形成三種mRNA 的產物，分別是 GAS7A、GAS7B 和 GAS7C；因此使 用相對於各種 isoform 之引子 (Table 3)來偵測細胞株 GAS7A、
GAS7B 和 GAS7C mRNA 的表現情形，其代表圖見Fig. 6A。GAS7C 的mRNA 在 A549 的表現量微弱，其他的細胞株都能看到明顯的 PCR 產物。GAS7B 的 mRNA 在每個細胞株都可偵測到 GAS7B 的 mRNA。
至於 GAS7A 的 mRNA 在 IMR90 和 A549 細胞株可看到 PCR 產物，
然而Bes2B 卻沒有偵測到 GAS7A 的 mRNA。
GAS7 蛋白在細胞株的表現方面，不同的細胞株以相同的 GAS7 抗體 (1:200, proteintech group, inc.)來偵測細胞內 GAS7 的蛋白含 量，其代表圖見Fig. 6B。在NCBI 網站上搜尋到的 GAS7 基因顯示，
其蛋白產物有三種不同分子量的isoform，分別是 GAS7A：38 kDa，
GAS7B：48 kDa 和 GAS7C：54 kDa；我們可以發現：的確在蛋白質 的層級上，我們也可以看到細胞能夠表現 GAS7B 和 GAS7C 的 isoform；並且在不同細胞株內，GAS7 蛋白的 isoform 表現量也都不 同。值得一提的是，正常肺細胞株 IMR90 與類似正常的肺細胞株 Bes2B，GAS7 蛋白的表現都以 GAS7C 為主；至於肺癌細胞株：A549，
它的 GAS7 蛋白表現則以 GAS7B 為主。而 GAS7A 的蛋白在肺臟中 表現量不多，甚至不表現。
(二) GAS7C 表達的確認
GAS7 蛋白產物有三種不同分子量的 isoform，分別是 GAS7A：
38 kDa，GAS7B：48 kDa 和 GAS7C：54 kDa；在前面細胞株的西方 轉漬膠圖結果顯示，IMR90 在大約 54 kDa 和 48 kDa 的位置的確看 到有蛋白質的色帶。由於 GAS7C 的蛋白在人類細胞的表現，僅有 NCBI 的預測，並無相關的實驗證明。為了確定在西方轉漬法使用的 抗體在 GAS7C 相對位置呈色的蛋白色帶真的是 GAS7C，我們進一 步挑選 GAS7C 蛋白表現最多之 IMR90 細胞，在相對應的位置 (54 kDa)作膠體內水解 (in-gel digestion) (Figs. 7 A, B)，並將trypsin 水解 後的蛋白進行質譜分析 (MALDI-Q-TOF)，所得到的分析結果利用 Mascot 網站作蛋白質鑑定。我們鑑定了 IMR90 細胞株在相同位置的 蛋白點作兩重複，所得的結果代表圖見 Fig. 7C。在 IMR90 的蛋白 點裡面，的確比對到GAS7C 的蛋白存在。由此可確定 GAS7C 蛋白 的確會表現在人類正常肺細胞。
(三) GAS7 蛋白在肺細胞株 IMR90 及 A549 分佈的情形
利用細胞免疫染色的方法來觀察細胞內GAS7 蛋白的分佈情形，
其代表圖見 Fig. 8。兩個細胞株皆使用相同的 GAS7 抗體 (1:200, Abcam, Cambridge, USA) 處理，再以有接紅螢光的 anti-GAS7 二級抗 體加以染色，因此用螢光顯微鏡觀察細胞內的GAS7 蛋白會呈現紅色 的反應。至於細胞核的部分，我們使用DAPI 染劑使之呈現藍色的反 應。經過染色後，我們可以發現：A549 細胞內紅色的地方分佈在細 胞核外 (與 DAPI 的染色比對)，細胞核看起來有中空的感覺 (綠色箭 頭所指)，因此推論 A549 內生性的 GAS7 蛋白 (以 GAS7B 為主)大多 分佈在細胞質中。而 IMR90 細胞內紅色的地方遍佈整個細胞內，因
此推論IMR90 內生性的 GAS7 蛋白質 (以 GAS7C 為主) 不僅分佈在 細胞質，同時也分佈在細胞核中。
二、探討臺灣地區肺癌病人 GAS7 基因/蛋白之變異情形
(一) GAS7 蛋白表達情形與病歷資料相關性
我們使用GAS7 的抗體 (1:200, Abcam, Cambridge, USA)，用免 疫組織染色的方法，分析75 位有病理切片的非小細胞肺癌病人的癌 組織切片之GAS7 蛋白表現，染色代表圖見 Fig. 9 A-D。實驗結果 顯示：在分析的75 個檢體中，有 57.3% (43/75) 的病人，其癌組織 切片之癌細胞的細胞核和質的褐色反應小於50%，判定為 GAS7 蛋 白低表達或不表達的病人。GAS7 蛋白的表現量的結果與病歷資料 作統計分析之後，發現 GAS7 蛋白低表達或不表達的情形，與病人 之性別、年齡、抽煙狀況、癌症種類、癌症分期間並無明顯相關性 (Table 4)。
由於免疫組織染色的方法只能觀察到 GAS7 蛋白的整體表現，
而無法觀察各種isoform 的表現情形。因此，在所收集的 75 個非小 細胞肺癌病人樣本中，挑選31 個癌組織樣本萃取高品質之蛋白質。
利用西方轉漬法，分析此31 位病人的癌組織的 GAS7 isoform 蛋白 表現，蛋白分析代表圖見 Fig. 10A。實驗結果顯示：我們可以在圖 上看到二條不同大小的蛋白，按分子量排序，由大到小分別是 GAS7C 和 GAS7B。然而，我們在病人的正常組織和癌組織內都沒 有發現GAS7A 蛋白的表現。在 GAS7C 蛋白表現的部分，有 48.4%
(15/31)的病人其 GAS7C 的蛋白呈現低表達的情形；在 GAS7B 蛋白 40.7% (11/27) 的病人，其 GAS7B 蛋白呈現低表達
的情形。將GAS7C 與 GAS7B protein 低表現的情形取聯集，則低表 現頻率可達46.2% (12/26)。
將GAS7C 或 GAS7B 蛋白低表現的結果與病歷資料作統計分析 之後 (Table 4)，發現GAS7C 或 GAS7B 蛋白低表達或不表達的情 形，容易發生在鱗狀上皮細胞癌的病人族群中，在統計上達顯著的 相關性 (P=0.045)。利用卡方方法分析 GAS7B 及 GAS7C 西方轉漬 法偵測蛋白質表現與免疫組織染色的方法之差異度。統計結果顯 示，GAS7B 及 GAS7C 西方轉漬法判讀為蛋白質低表現者，免疫組 織染色的方法亦判讀為低表現之蛋白分佈，且統計上達顯著相關 (P=0.007 及 P=0.01) (Fig 10B)。由此結果推測 GAS7C 或 GAS7B 蛋 白低表達，可能影響GAS7 isoform 蛋白的整體表現。
(二) GAS7 mRNA 表達情形與病歷資料相關性
利用 RT-PCR 方法，分析 92 位 NSCLC 病人癌組織及其鄰近正 常組織 GAS7 mRNA 表達情形。引子設計在 GAS7 mRNA 的 5’端，
來區分二種主要的mRNA isoforms GAS7C 及 GAS7B；詳細的引子位 置和 PCR 產物片段大小，如 Fig. 5 所示，RT-PCR 之代表圖見Fig.
11。實驗結果顯示：在 92 位病人中，GAS7C 和 GAS7B 的 mRNA
低表達或不表達的頻率分別為20.9% (19/91) 和 32.6% (30/92)；若將 GAS7C 與 GAS7B mRNA 低表現的情形取聯集，則低表現頻率可達 45.1% (41/91)。另外，將 GAS7C 或 GAS7B 的 mRNA 低表現結果與 病歷資料作統計分析之後 (Table 5)，發現 GAS7C 或 GAS7B mRNA 低表達或不表達的情形，容易發生在年紀較大（＞65 歲）的病人族 群中，在統計上接近顯著的相關性 (P=0.051)；並且和抽煙的病人及 鱗狀上皮細胞癌有接近統計顯著性的相關性存在 (P=0.055)。
(三) GAS7 基因啟動子過度甲基化情形與病歷資料相關性
由於mRNA 低表現常是因為基因之啟動子過度甲基化所致，所 以本研究以 bisulfite sequencing PCR□(BSP) 的方法來鑑定較不表 現之 GAS7C 與 GAS7B 之啟動子甲基化狀態。設計不同之引子，分 別來增量GAS7C 和 GAS7B 的啟動子內包含 CpG islands 之 DNA 區 域後，所得的 PCR 產物，經過定序後加以分析 CpG islands 之甲基 化狀態。BSP 代表圖見 Fig. 12。實驗結果顯示：經過挑選並分析的 36 位病人中，16.7% (6/36)病人的 GAS7C 基因啟動子有過度甲基化 的情形；65.6% (21/32)病人的 GAS7B 基因啟動子有過度甲基化的情 形。另外與病人的病歷資料作統計分析之後，發現 GAS7 基因啟動 子過度甲基化情形，與病人的年齡、性別、抽煙狀況、癌症分期間 並無明顯相關性存在 (Table 6)。
(四) GAS7 基因的異質性喪失分析 (loss of heterozygosity, LOH) 由於 GAS7 基因位在一個染色體不穩定的區域，並且 mRNA 低 表現也有可能是因為與基因座缺失有關，因此本研究進一步以 LOH 方法分析GAS7 基因座缺失的情形。在 LOH 分析實驗中，使用分別 為在 GAS7 基因座內 5’及 3’端的兩個微衛星序列(AFMA070WD1、
D17S945)，針對 92 個 NSCLC 病人的 GAS7 基因區域進行分析 (Fig.
13)。結果顯示，這兩個微衛星序列 AFMA070WD1、D17S945 在 92 個病人中的 LOH 頻率分別是：5.5%(4/73)和 16.3%(14/86)，若以 AFMA070WD1 或 D17S945 任一缺失判定 GAS7 基因座缺失，則缺 失的頻率可達20.7% (18/87)。
(五) GAS7 mRNA、蛋白不表達與啟動子甲基化間之相關性
利用Pearson χ2 test 分析 GAS7 mRNA、蛋白不表達與啟動子甲 基化之間之相關性研究，代表圖見 Fig. 14。首先分析 GAS7B 或 GAS7C mRNA 的表現情形與 GAS7 蛋白表達之間的相關性：在 GAS7B 或 GAS7C mRNA 有表達/GAS7 蛋白亦有表達，和 GAS7B 或 GAS7C mRNA 低表達/GAS7 蛋白亦低表達的病人佔全部之 65.3%
(49/75)，二者間達顯著相關性 (Fig. 14A, P＝0.004)，顯示 GAS7 mRNA 與蛋白表達情形有相當大的一致性。而在 GAS7C
、
7B 啟動 子過度甲基化與否和 mRNA 表達情形的一致性方面：發現 GAS7C 啟動子過度甲基化/mRNA 低表達，與啟動子沒有過度甲基化/mRNA 有表達的病人佔全部之 80.6% (29/36)，二者間達顯著相關性 (Fig.14B, P＝0.038)；GAS7B 啟動子過度甲基化/mRNA 低表達，與啟動 子沒有過度甲基化/mRNA 有表達的病人佔全部之 71.9% (23/32)，二 者間達顯著相關性 (Fig. 14B, P＝0.004)，這顯示了 GAS7 mRNA 的 表達情形和啟動子甲基化的情形有相當大的一致性。
柒、討論
癌症，一直是國人十大死因的首要原因；在這麼多癌症當中，
又以肺癌的致死比例最高，並且有逐年增加的趨勢。根據衛生署最 新統計，肺癌在國人癌症排行中，男性居第二，女性居首位 (1)。
肺部是一個與空氣直接接觸的臟器，空氣污染物容易進入肺臟，再 加上許多肺癌患者有抽煙或接觸環境中致癌因子的情形，長期受到 致癌因子的刺激，而造成細胞無限制的增生與擴散，就可能導致癌 細胞的形成。
由於肺癌難以早期偵測，開刀成功率或化療效果皆不理想，而
由於肺癌難以早期偵測，開刀成功率或化療效果皆不理想，而