一、原理
正常細胞由於細胞膜完整，遇到加入 trypan blue 染劑時，
則不會被染色；反之，死細胞或是受損的細胞則因細胞膜通透 性已被破壞，染劑可進入細胞內加以染色。經 trypan blue 染後 成為藍色細胞則為死細胞；細胞呈現亮點則為活細胞。細胞成 長率(cell growth)亦稱之為 subconflent，也就是將細胞種到未全 滿的階段，加入藥物試劑反應，確認是否會抑制細胞成長；細 胞存活率(cell viability)亦稱之為 conflent，也就是將細胞種到全 滿的階段，加入藥物試劑反應，確認藥物是否對於細胞具有毒 性的分析方法。
二、細胞型態(Morphology)觀察
在12 well中種2×105 cells/mL (共1 mL)的HaCaT cells，等至 細胞貼附後，加入含不同濃度Lucidone的培養液（含1% FBS）
後培養24、48、72小時。以倒立式顯微鏡(phase microscope)觀 察細胞型態並照相。
三、存活率測定步驟【Lee et al., 2005】
在 12 well 中種 2×105 cells/ml (共 1 ml)的 HaCaT cells，等 至細胞貼附後，加入含不同濃度 Lucidone 的培養液（含 1% FBS）
後培養 24、48、72 小時。等反應時間到了之後，從中取出 100 μl 再加上 100 μl 的 0.4% trypan blue，混合均勻後，以血球計數 器來計算 HaCaT cells 的數目。
五、 細胞計數
將細胞懸浮液與trypan blue等體積混合，取出100 μl混合液 注入血球計數盤凹槽中，於倒立式顯微鏡下觀察計數。計算盤 中上下共八大方格中細胞總數後除以八，乘以稀釋倍數，最後 再乘以104(血球計數盤每一方格的體積為10-1 mm3)，即為每ml 中細胞懸浮液之細胞數。
第七節、MTT 存活率試驗（MTT assay）
（1）原理
MTT ( 3-(4,5-dimethylthylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra- zolium bromide )是一種水溶性的 tetrazolium salt，當溶解於 PBS 緩衝 液 中 ， 會 形 成 淡 黃 色 的 溶 液 ， 在 細 胞 內 會 經 由 粒 線 體 酵 素 dehydrogenase 還原，MTT 的環狀結構 tetrazolium ring 會被切斷進而 轉換成藍紫色不溶於水的 formazan 結晶，再利用 10% SDS 或是
色 formazan 結晶溶解，然後取 200 μL 溶液置於 96 孔盤中，以 ELISA reader 讀取波長 570 nm 的吸光值。
第八節、細胞內活性氧化物(Reactive oxygen species)產量測 定分析
一、原理
2,7- dichlorofluorescein diacetate (H2DCF-DA)是一種脂溶性 染劑，本身具有螢光且可以通透細胞膜，進入細胞可與細胞內 的 乙 醯 脂 酶 (esterases) 結 合 形 成 非 螢 光 性 還 原 型 的 2’,7’ –dichlorofluorescin (DCFH)，接著會被 H2O2氧化成具螢光 性的 2’,7’ –dichlorofluorescein (DCF)。當 DCF 受到 485 nm 波長 的光激發後，會散射出 530 nm 波長的螢光，可利用螢光光譜儀 (fluorescence spectrophotometer)來偵測。利用 H2DCF-DA 的螢 光特性對細胞進行染色，可用來評估細胞內 H2O2的濃度變化，
以分析細胞內 ROS 的生成量。
二、試劑配製
(一) 2,7- dichlorofluorescein diacetate(H2DCF-DA)染劑
分子量為 487.3，將其配成 stock solution 為 10 mM，
實驗前用已滅菌磷酸緩衝溶液稀釋成 10 μM。
三、實驗步驟
將 HaCaT 細胞種於 12 well (2×105/well)，隔天細胞貼壁後，
換成含 1% FBS 的 DMEM 培養液置於 37℃、5% CO2培養箱中 隔夜(overnight)。以不同濃度的 Lucidone 加入含 1% FBS 的 DMEM 培養液置於 37℃、5% CO2培養箱中培養 24 小時後，以 PBS 清洗後，再換上含有 30 mM AAPH 的 1% FBS 的 DMEM
培養液置於 37℃、5% CO2培養箱中培養 4 小時後，以 PBS 清 洗 2 次後，再加入含有 10
M H
2DCF-DA 的培養液（含 1%FBS），於 37℃下反應 30 分鐘後，以 PBS 清洗 3 次去除多於 染劑後，最後每格加入體積 500 L 的 0.25% Triton®X-100 打破 細胞，再以黑色 96 孔盤拿到激發波長設定為 485±20 nm、散射 波長設定為 528±25 nm 的螢光光譜儀測定吸光值。
第九節、蛋白質定量分析與西方墨點法 (Western blotting)
【Pan et al., 2008】
一、蛋白質定量原理
蛋白質定量分析是根據 Bradford 原理所設計，其蛋白質染 劑可與蛋白質結合形成藍色複合物，並可於 595 nm 測得此複合 物之吸光值。藉由比對 BSA 標準品所形成的定量標準曲線，即 可換算出待測樣品的蛋白質濃度。
二、蛋白質定量實驗步驟
以二次水將牛血清白蛋白 (bovine serum albumin；BSA，
0.1 mg/ml)分別配製成 0、2、4、6、8、10 μg /mL 之標準溶液，
也就是 eppendorf 分別先加 800、780、760、740、720、700 mL 的二次水，再依序分別加入 0、20、40、60、80、100 mL 的 BSA 就是所要濃度的標準液。接著再加入 200 μL protein assay dye (BIO-RAD)，振盪均勻後靜置 5 分鐘。加在 96 孔盤，標準液序 列做三重複，接著放入分光光度計讀取波長 595 nm 的吸光值，
由在 595 nm 的吸光值，作成標準線，分析最佳標準迴歸直線，
求出此線的方程式(當此直線的迴歸分析結果之 R2＞0.998 時，
此直線方程式的值始可信)。
將樣品取 1 μL 的待測蛋白質溶液加入 799 μL 二次蒸餾 水，再加入 200 μl protein assay dye，均勻混合後，室溫下反應 5 分鐘後，加在 96 孔盤測，待測蛋白質溶液做二重複，接著放 入分光光度計讀取波長 595 nm 的吸光值，吸光值再以樣品所測 得 OD 值之結果，帶入方程式即可求得蛋白質濃度。
三、西方墨點法原理
Western Blot 採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，
被檢測物是蛋白質，「探針」是一級抗體(Primary antibody)，「顯 色」用標記的二級抗體(Secondary antibody)。SDS 是界面活性 劑，可使蛋白質變性，並在分子表面均勻佈上一層負電荷。因
(5) 2 mM dithiothreitol (DTT)
(6) 1 mM phenylmethyl sulfony fluoride
2、步驟：
(五) Ammonium persulfate
取 0.1 g (NH4)S2O8溶於 1 ml 二次水。
(六) 6× Protein loading dye 1、材料：
(1) 350 mM tris-HCl (pH=6.8) (2) 12% SDS
(3) 35% glycerol
(5) 30% β-meanptoethanol 2、步驟：
(1) 秤取 1.379 g tris-HCl 並加入 5 ml 二次水混合，調整 pH 值為 6.8。
(2) 加入 3 g SDS、8.75 ml glycerol(原液)、0.005 g bromophenol blue、7.5 ml β-meanptoethanol 混合，
最後定量到 25 ml。
(七) 5× electrode buffer (pH=8.4)
取 54.5 g tris base、24.8 g boric acid、4.7 g Na2EDTA、 5 g SDS，最後用二次水定量至 1000 ml。使用前再用二次水 稀釋成 1×。
(八) Transfer buffer
取 18.2 g tris base、86.5 g glycine、1200 ml methanol 最 後用二次水定量至 3 L。
放入避光的盒子。
(十三) SuperSignal substrate solution
將 SuperSignal I：SuperSignal II＝1：1 混合 (每次使用 皆現配) 。
五、西方墨點法實驗步驟
(一) 細胞溶解萃取(Cell lysis extraction)
HaCaT 細胞種於 10 公分培養盤，每盤細胞密度 3×106 cells/plates，實驗條件同前述方法。將經過 Lucidone 反應 的 HaCaT 細胞，收集培養液於離心管中，離心 1500 rpm， 即為細胞萃取物(cell lysis extracts；total protein)。最後以 Bio-rad 定量其蛋白濃度，保存在-80℃冰箱備用。
(二) 蛋白質膠體電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis；SDS-PAGE)
1、鑄膠
膠體的配製依蛋白質分子量的大小而決定配製成 8、10、12、15%的 SDS-PAGE。
2、分離膠體溶液(Running gel；總體積 10 ml) (1) 8% SDS-PAGE
加 4.6 ml H2O，2.5 ml 1.5M Tris (pH=8.8)，2.7 ml 30% acrylamide mix，0.1 ml 10% SDS，0.1 ml 10%
ammonium persulfate 及 0.005 ml TEMED。
(2) 10% SDS-PAGE
加 4 ml H2O，2.5 ml 1.5 M tris base(pH=8.8)，
3.3 ml 30% acrylamide mix，0.1 ml 10% SDS，0.1 ml 10% ammonium persulfate 及 0.005 ml TEMED。
(3) 12% SDS-PAGE
加 3.3 ml H2O，2.5 ml 1.5M tris base (pH=8.8)，
4.0 ml 之 30% acrylamide mix，0.1 ml 之 10%
SDS，0.1 ml 之 10% ammonium persulfate 及 0.005 ml TEMED。
(4) 15% SDS-PAGE
加 2.3 ml H2O，2.5 ml 1.5M tris base (pH=8.8)，
5 ml 30% acrylamide mix，0.1 ml 10% SDS，0.1 ml 10% ammonium persulfate 及 0.005 ml TEMED。
3、集離膠體溶液(5% Stacking gel；總體積 6 ml)
加入 4.2 ml H2O，0.78 ml 之 1.5 M tris base (pH=6.8)，1 ml 之 30% acrylamide mix，0.06 ml 之 10%
SDS，0.06 ml 之 10% ammonium persulfate 及 0.006 ml 之 TEMED。
質樣本變性(denature)後，立即放回冰靜置 5 分鐘，speed
6、蛋白質轉移(Transfer protein to PVDF membrane)
先將 PVDF membrane 及 3M paper 裁剪與膠片大 小相同。於 PVDF membrane 標記上膠片之蛋白質 marker 的位置，方便偵測蛋白質訊號時比對分子量大 小位置。將轉漬夾打開後黑色面朝下放，取出一片海 綿墊片浸泡 transfer buffer 後放於其上面，並依序在海 綿 片 上 放 上 3 mm paper 、 SDS-PAGE gel 、 PVDF membrane (先用 100%甲醇濕潤 5 秒、再放於 transfer buffer 中浸潤)、3 MM paper，最後再放上一片海棉墊 片後夾上轉漬夾，並使用玻棒壓一壓以去除氣泡(夾層 中間切勿有氣泡)，放入濕式 transfer machine 中並將 transfer buffer 倒入電泳槽中，以 20 伏特的電流轉印 15 小時(由負極到正極)，使蛋白質轉印到 PVDF 上。
7、免疫點墨法 (Immunoblotting)
轉印好蛋白質之 PVDF memberane 用 blocking solution 振盪 30 min，以 blocking solution 作為溶劑分 別將欲測之一次抗體稀釋至適的濃度，加入 PVDF membrane 使其均勻的覆蓋於 membrane 上，並置於水 帄式旋轉器上室溫振盪 3 小時，用 washer buffer 洗三 次，轉速為 100 rpm 每次 10 分鐘。依不同的一次抗體，
加入特異作用的二次抗體，置於水帄式旋轉器上室溫 振盪 3 小時，用 washer buffer 洗三次，轉速為 100 rpm 每次 10 分鐘，藉此清洗未接合二次抗體，同時也可以 降低背景值。將 PVDF membrane 加入 superSignal WestPico chemiluminesent substrate 溶液，振盪 1 分鐘，
（1）將轉印膜用保鮮膜完整包裹，使用 Amersham WestPico chemiluminesent substrate 螢光液的 PVDF 膜 放到帄盤上，蓋上分析儀門，調整焦距及亮度，即可 開始照相，照相時間設定依所要分析的蛋白螢光強度 不同而有所不同，每照完一次儲存影像，影像的 bands 以分析軟體積分及統計軟體做組間差異。
三明治夾(白) 海棉墊
3M 紙 PVDF 膜 膠 3M 紙 海棉墊
三明治夾(黑)
＋
－ 電極
第十節、細胞酵素連結免疫分析法(PGE2)
一、 原理
此市售試劑套組是以競爭性免疫分析方法進行 PGE2分析。
細胞培養之上清液中 PGE2與 HRP 標示之 PGE2競爭 mouse monoclonal antibody，然後 PGE2-antibod complex 結合到含有二 級抗體 (gout anti-mouse polyclonal antibody)的 96 孔盤底，培養 一段時間後，移除物結合的物質，加入 substrate solution 作用，
再加入硫酸終止反應，產生深淺不一的黃色產物，於 450 nm 下 測定吸光值，用來評估 PGE2酵素的活性。吸光值愈高表示培養 液中 PGE2酵素含量愈少，並可利用標準品序列稀釋得到的標準 曲線來換算細胞培養液中 PGE2的含量。
二、 試 劑 （ 市 售 Prostaglandin E2 immunoassay kit ； R&D Systems）
1. Goat Anti-mouse Microplate。
2. PGE2 Conjugate。
3. PGE2 Standard。
4. Primary Antibody Solution：用於稀釋標準品及培養液。
5. Calibrator Diluent RD5-39。
6. Wash Buffer：取 25 mL 的 Wash Buffer Concentrate 加二次水定 量到 500mL。
7. Color Reagent A and B：使用前以 1：1 方式混合配成 Substrate Solution，15 分鐘內使用完，全程須避光操作。
8. Stop Solution。
三、 方法
實驗前將細胞種於 12 well-plates，密度 2×105 cells/well，隔天 換成 1% FBS 培養液 overnight，接著加入含不同濃度 Lucidone 的 1% FBS 培養液培養 24 小時後，再換成含 30 mM AAPH 的 1% FBS 培養液反應 4 小時後，分別收集不同組別細胞上清液，
離心後即可以上清液做 kit。
1. Microplate 加入 150 L 的 Calibrator Diluent RD5-39 作為 NSB 組。
2. 加入 100 L 的 Calibrator Diluent RD5-39 作為 zero standard (B0) wells。
3. 加入 100 L 的 Standard、control 和 sample*。（*sample 是細胞 培養上清液需事先以 3 倍稀釋：150 L 上清液+ 300 L 的 Calibrator Diluent RD5-39）
4. 再加入 50 L 的 Primary Antibody Solution 到每格（NSB 組除 外）。
5. 再加入 50 L 的 PGE2 Conjugate 到每格。
6. 置於 shaker 上室溫反應 2 小時。
7. 以 Wash Buffer 清洗 4 次。
8. Color Reagent A and B 以 1：1 方式混合配成 Substrate Solution，
每格各加入 200 L，避光反應 30 分鐘。
9. 每格加入 50 L 的 Stop Solution。
10. 30 分鐘內以波長 450 nm 測定吸光值
11. 以% B/B0對標準品濃度建構標準曲線，並以 four parameter logistic (4-PL) curve-fit 求出樣品中 PGE2濃度。（Y 軸吸光值設 定 linear y-axis，X 軸濃度設定 logarithmic x-axis）
第十一節、細胞遷移試驗 (Transwell invasion assay)
一、 原理
利用 Matrigel invasion chamber，將細胞種在上層盤的 Insert 內，若細胞有遷移情形，則會穿過 Insert 內的 Matrigel 及 8 m 孔洞的濾膜，掉落至下層盤的 well 中，造成細胞 侵入性的現象。
二、 方法
先將 invasion chamber 專用 24 孔下層培養盤各加入 750
L 含 10% FBS 的培養液，再將
BD Matrigel™ Invasion Chamber 從-20℃拿出，將已預先覆蓋 (coating) Matrigel 的上層盤 insert 先放入已加培養液的 24 孔下層盤中，並 在 37℃培養箱復水反應 2 小時，接著將 HaCaT 細胞以 Trypsin- EDTA 處理後，使細胞懸浮，將細胞離心，以 1×105 cells/well 的細胞密度均勻懸浮在已加入不同濃度 Lucidone 且含有 1% FBS 的培養液中，接著控制各組總 體積 500
L 並加入 insert 內 (8 m pore size, polycarbonate
memebrane)，移入37℃、5% CO2的培養箱中反應 24、48 小時，之後將 invasion chamber 拿出，將上層盤 insert 倒 扣在紙巾上，以 75%的冰乙醇(或 100%甲醇)固定 15 分 鐘，之後置於室溫下自然乾燥 (約 20~30 分鐘)。以×105 cells/well 的細胞密度均勻懸浮在已加入不同濃度 Lucidone 且含有 1% FBS 的培養液中，接著控制各組總 體積 500