可能較適合用於平整面樣品上之生物膜萃取。直接萃取法雖可得到較 好的萃取效率，但 A260/A280仍無法達到1.7 以上，其原因為萃取樣品 為混菌系統且底泥有許多未知物干擾，故萃取效率無法達到標準值。
表 4-1 電極 DNA 萃取效率比較
A260/A280＊ DNA 濃度 (ng/μl)
振盪離心法 1.25 8.5
直接萃取法 1.52 19.4
*A260/A280 :比值＞1.7 表示 DNA 純度較高，或蛋白質汙染較少。
**皆取 1g 電極樣本進行 DNA 萃取。
將直接萃取後底泥及電極 DNA 樣品經瓊脂膠體(agarose)電泳初 步確認 DNA 萃取之效果及產量，因底泥及電極 DNA 分子量較大(大 於 10 kb)，故使用 0.8%洋菜膠進行電泳來確認萃取 DNA (Sambrook et al., 2001)，由圖 4-1 可得知 Ln 1 和 Ln 2 在 agarose gel 上亮帶並不明 顯，表示其DNA 濃度較低，故須先進行 PCR 放大反應，才能獲得足 夠濃度的產物以進行陽極菌相分析。
圖 4-1 底泥及陽極萃取 DNA 在 0.8%洋菜膠分離 2h 之結果。Ln 1 底 泥 DNA，Ln 2 未添加基質之陽極 DNA，Ln 3 直接添加基質之陽極 DNA，Ln 4 管柱添加基質之陽極 DNA。
4-2 PCR 放大
由圖 4-1 結果顯示，所萃取之底泥及陽極電極 DNA 濃度較 低，故必須先進行 PCR 放大提高 DNA 之濃度，影響 PCR 產物濃度 的因素很多，例如：Tm 值、Mg2+濃度、Taq 效率等，或藉由增加 Taq polymerase 的含量、改變 DNA template、primer 的比例、改變 PCR 黏合溫度或降低 DNA 中抑制物的含量等方式來改善 PCR 反應，也可 利用PCR 純化套件組或巢式 PCR (nested PCR)來提高產物濃度(Dar et al., 2005)。
1 2 3 4
DNA →
4-2-1 DNA 之稀釋 為比值應在 1.2 以上可避免腐植酸的影響(Steffan et al., 1988；Yeates et al., 1998)。研究發現，無論 DNA 濃度多高，只要有 1 μl 未稀釋的腐 植酸物質存在，都足以抑制PCR 反應進行(Tsai and Olson，1992)。由 表 4-2 可得知本研究底泥及電極樣品 DNA 的 A260/A230 比值約在 ng/μl 之間。因為 Shewanella putrefaciens 為文獻中指出之產電菌 (Lovley, 2006)，而 Pseudomonas pseudomallei 在土壤及水池環境中常
被發現(Smith et al., 1995)，故選擇此兩株菌為對照菌。兩菌株之 DNA
Shewanella putrefaciens 1.98 1.35 75.3
Pseudomonas pseudomallei 2.10 1.17 88.7
*A260/A280 :比值＞1.7 表示 DNA 純度較高，或蛋白質汙染較少。
**A260/A230 :比值＞1.2 表示 DNA 受腐植酸干擾較小。
由圖 4-2 所示，未經稀釋的 DNA 樣品以 PCR 反應後，無法得到 產物(Ln 2-5)，膠體上無亮帶出現，推測其原因可能是未經稀釋之 DNA 中含有抑制 PCR 反應之物質。文獻指出可利用純化(Sambrook and Russell, 2001)去除抑制 PCR 反應的物質，亦有研究指出可使用稀釋法 來降低抑制物的干擾(申，2004)，因此本研究選用稀釋法將 DNA 樣
品進行稀釋，同時達到降低抑制物的濃度。由圖 4-2 可看出，將 DNA 樣品稀釋 100 倍後(Ln 6-9)，再進行 PCR 反應，膠體上有明顯亮帶出 現，因此在處理底泥及電極 DNA 樣品時須先稀釋，再進行 PCR 放大 反應，才能獲得所需 PCR 產物。
圖 4-2 稀釋作用對 DNA 樣品以 PCR 放大之影響。Ln 1:1kb Marker，
Ln 2-5 為萃取 DNA 直接進行 PCR 反應，其樣品分別為底泥、未添加 基質之電極樣品，操作 463 天管柱添加之陽極樣品、操作 463 天直接 添加之陽極樣品；Ln 6-9 為萃取之 DNA 稀釋後(100×)進行 PCR 反應，
樣品之次序如 Ln 2-5，以 1.5%洋菜膠在 120V 下，進行電泳 2 h 之電 泳。
3 5 7 1 2 4 8
1 kb →
6 9
→ PCR 產物 (1.4 kb)
4-2-2 巢式 PCR
巢式 PCR 其目的是為了增加 PCR 產物濃度，其優點可提高 PCR 產物的敏感度，本研究使用 PCR 和巢氏 PCR 對樣品進行放大反應。
直接PCR 是利用 341fGC-534r 進行放大反應。巢式 PCR 是以 11f-1492r 之universal bacteria 引子進行第一次 PCR 放大反應，再以 341fGC-534r (Muyzer et al., 1993)進行 PCR 放大，最終產物片段皆為 198 bp。圖 4-3 是比較 DNA 樣品以 PCR 和巢式 PCR 放大效果，Ln 2-5 為一般 PCR 放大可看出亮帶較淡，Ln 6-9 為巢式 PCR 之結果，可顯示出亮帶較 清晰，因此選擇以巢式 PCR 來提高 PCR 產物濃度，以利進行後續 DGGE 實驗。圖 4-2 中直接 PCR 有亮帶出現(Ln 6-9)，但圖 4-3 卻沒 有亮帶出現(Ln 2-5)，因兩張圖中樣品所使用之引子長度不同(1481 bp 和 198 bp)，故圖 4-3Ln 2-5 雖然也是用直接 PCR 處理樣品，因所夾 取樣品 DNA 片段較短導致亮帶較不明顯。其中因巢式 PCR 是進行兩 次 PCR 放大，實驗過程加入反應試劑時容易出現交互污染，要避 免 PCR 產物污染後續實驗，最好是將執行電泳的空間與萃取樣品、
配製試劑的空間區隔開來。
圖 4-3 DNA 稀釋樣品直接以 PCR 放大和巢式 PCR 放大之比較。Ln 1:100 bp Marker，Ln 2-5 為直接使用 341fGC-534r 進行 PCR 放大產 物，Ln 6-9 經巢式 PCR 後所得的產物，其中 Ln 2-3、6-7 為底泥樣品，
Ln 4-5、8-9 為電極樣品，以 2%洋菜膠在 120V 下，進行電泳 2 h 之 電泳。
2 4 6 8
500 bp→
1 3 5 7 9
→ PCR 產物(198 bp)
4-3 DGGE 分析
4-3-1 變性梯度範圍
變性梯度膠體電泳(DGGE)一般常選用變性劑濃度範圍為 40-60%
或 40-80% (Helms, 1990)，然而各樣品均有其各自之濃度範圍。圖 4-4 為 DGGE 膠體變性劑濃度之分析，底泥及電極樣品經 11f-1492r 及 341fGC-534r 進 行 巢 式 PCR 放 大 反 應 後 ， 尿 素 (urea) 及甲 醯 胺 (formamide)所組成的變性劑在變性濃度 0-90 %下，膠體濃度 10%
polyacrylamide，以垂直變性梯度膠體進行測試，電泳條件為 80 V，6 h，由圖 4-4 可判斷出 SMFC 樣品中 DNA 在變性劑濃度 35-75%可被 分離，為確保樣品能完全分離，故選擇 30-80%為變性劑範圍。
0% 90%
圖 4-4 DGGE 膠體變性劑濃度之分析。膠體濃度 10% 聚丙烯醯胺 (polyacrylamide)，變性劑濃度 0-90%，電壓 80V，電泳時間 6 h。
Denaturant
Electrophoresis
45% 75%
4-3-2 底泥微生物燃料電池(SMFC)菌相與電力之比較
DGGE 著重於分析環境中菌相組成，由圖譜中不同樣品之條帶分 布作為判斷依據，條帶位置相同，可以判斷屬於相同菌群，而亮帶強 弱 及 位 置 出 現 頻 率 可 判 斷 樣 本 中 優 勢(predominant) 及 普 遍 存 在 (common)菌種(Muyzer and Smalla, 1998)。
圖4-5 (a) 為底泥微生物燃料電池(SMFC)陽極生物群以 DGGE 分
而直接添加基質與未添加基質之電極樣品亮帶皆為 18 條，由亮帶數 目可發現菌相在原始底泥中數目(15 條)最少，管柱添加基質之樣品亮 帶(25 條)最多，顯示經基質添加可使 SMFC 陽極生物菌群增加，並可 獲得最多優勢菌種。
DGGE 圖譜中 Ln 1 為 Shewanella putrefaciens，該菌為文獻中指出 之產電細菌(Lovley, 2006)，在原始底泥中有與 Shewanella putrefaciens 相同位置之條帶，即表示底泥中原本即含有產電細菌，經操作後產電 菌數量增多(亮帶明顯)，其中又以管柱添加基質後(Ln 7、8)亮帶最為 明顯且樣品上優勢菌種數目最多(6 條)，顯示出管柱添加基質方式較 適合產電細菌利用基質。Ln 2 為 Pseudomonas pseudomallei，此菌在 土壤及水池環境中常被發現(Smith et al., 1995)，故選擇此菌為對照菌 株，該菌為純菌，在 DGGE 圖譜中應只會呈現一條亮帶，但 Ln 2 上 卻有四條明顯亮帶，推測其原因可能是進行 PCR 放大反應時，此株 純菌之 cycle 太高(35 cycle)，導致 PCR 產物濃度過高出現非專一性產 物，因此在後續實驗中需進行切膠定序以確定是否為非專一性產物。
利用 DGGE 分析 SMFC 陽極樣品之菌相組成，可將膠片上普遍存在 及亮帶較強之優勢菌切下並進行定序，其定序結果再與 NCBI 資料庫 進行序列比對，鑑定出可能菌種。
圖 4-5 (a) 底泥微生物燃料電池(SMFC)陽極生物群以 DGGE 分析圖 譜，產物大小為193 bp。Ln 1 為Shewanella putrefaciens，Ln 2 為Pseudomonas
pseudomallei，Ln 3-4 為底泥，Ln 5-6 為直接添加基質方式操作 463 天
之陽極樣品，Ln 7-8 為管柱添加基質(285 天)之陽極樣品，Ln 9-10 為 未添加基質之 SMFC 陽極對照組。(b) 膠片亮帶位置繪製圖，＃代表 普遍存在菌群，＊代表優勢菌群。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Denaturant
80%
(a) 30%
(b)
3.1 mW/m2，優於基質以直接添加之 SMFC (最高功率密度為 2.3 mW/m2)，兩種不同添加方式的電池電力皆高於未添加基質之 SMFC (0.1 mW/m2)電力，可看出電力大小依序為管柱添加基質(3.1 mW/m2)
＞直接添加基質(2.3 mW/m2)＞未添加基質(0.1 mW/m2)。由 DGGE 圖 譜中發現，管柱添加基質之 SMFC 陽極電極菌相最豐富，產電量亦最 高。
表4-3 基質添加方式對底泥微生物燃料電池之 產電效率影響(侯，2010)
底泥微生物電池 最高電壓(mV) 功率密度(mW/m2)
未添加基質(463 天) 36 0.1
直接添加基質(463 天) 160 2.3
管柱添加基質(285 天) 184.5 3.1