4.1 苦花雌性激素受體基因選殖
選取六種魚類，即gilthead sea bream.( AJ006039 )、Oryzias sp（D28954）
）、Oncorhynchus mykiss（AJ242740）、channel catfish（AF061275）、Atlantic croaker
（AF298181）、goldfish（AF061269）比對後的高度演化保守區域(high conserved region)設計兩條核甘酸引子，再以三種魚3′RACE反應之first strand cDNA作為起 始模版，經PCR擴增後進行2﹪凝膠電泳，經Etbr染色觀察到約0.9kb的位置有DNA 亮帶，進行次選殖及DNA定序，可得到950bp的DNA序列，在NCBI網站進行基 因比對，確定是雌性激素受體之基因片段，再以5′RACE反應之first strand cDNA 作為起始模版，根據所獲得的DNA序列設計引子進行PCR，可觀察到約0.8kb處 有DNA亮帶，進行次選殖及定序以獲得受體基因在5′端位置的DNA序列，同樣以 3′RACE反應之first strand cDNA作為起始模版，已知950bp的DNA序列設計另一 引子進行PCR，則在約1.3kb位置有DNA亮帶，接著進行次選殖及定序以獲得3′
端位置的DNA序列，將三段基因比對組合以獲得受體基因全長之序列，共可獲 得兩條苦花雌性激素受體基因全長，分別為estrogen receptor alpha (ERα)及 estrogen receptor beta (ERβ)，其基因序列及轉譯的蛋白質見圖3及圖4。其中，苦 花ERα則可轉譯出568個胺基酸的蛋白質，分子量為63064。ERβ則可轉譯出612 一方面，標的序列結合區域(target gene)亦與 pLacZi 載體結合，並定序加以確 認，再以 Nco I 截切後轉形送入酵母菌 YM4271 中。然後再將重組的 pGAD424 表現載體轉形送入酵母菌，以 colony-lift filter assay 篩選出最具活性的分離菌 落，加入不同濃度的受測物紀錄其轉錄活性(transactivation)，可得一濃度-反應 關係圖（圖 5、圖 6），經轉換並進行 curve fitting 可求得 ligand efficiency 及 ligand potency；ligand efficiency 即為受測物可誘發最大半乳醣脢的活性，ligand potency 為達到最大半乳醣脢誘導活性一半時的受測物濃度，又稱為 EC50，ligand efficiency 為雌性激素受體與轉錄複合體(transcription complex)的穩定有關，
ligand potency 則為受測物與雌性激素受體的親和力(affinity)有關，受測物對 ERα及 ERβ的參數整理見表 3，在 ligand efficiency 方面，不同受測物對 ERα酵 母菌轉殖株的排序由強而弱依序為 E2 > 4-NP > BPA > 4-t-OP，對 ERβ酵母菌轉
殖株則有不同排序依序為 E2 > BPA > 4-t-OP > 4-NP，另外，同一受測物對 ERα 酵母菌轉殖株的 ligand efficiency 一般來說較 ERβ酵母菌轉殖株來的高；在 ligand potency 方面，E2 為最低，表示在 nM 即可敏感誘發轉錄活化，4-NP 及 要的，本實驗以 E2+BPA、E2+4NP、BPA+4NP 進行混合實驗，並繪製成圖表(表 6 及圖 11~13)，由結果可知，由預測其加成反應（表 7）數據來看，大部分的 混合效應為加成反應，只有 BPA+4NP 的混合呈現擷抗反應，但亦有可能是實 驗在低濃度時所造成的誤差，因為在混合實驗中其變異係數在最低濃度混合時 有 57~93 ﹪的變動，本實驗與其他實驗的結果比較，如 knudsen et al. [12] 以 Ranibow trout 進行實驗，混合的物質為 octylphenol+butyl benzyl thalate、octyl phenol+estradiol 並偵測 zona radiata protein (Zrp)為反應終點，結果顯示均為相 加效應，而在 Arukwe et al. [14]以 Atlantic salmon 為實驗物種，偵測的反應終點
則為 Zrp 及 vitellogenin，結果 NP 與 lindane (γ-HCH)有擷抗效應，在 Thorpe et al.
[20]進行 E2+NP、E2+methoxychlor(MXC)、MXC+NP 的混合實驗，以 Rainbow trout 為實驗物種，Vitellogenin 為反應終點，結果顯示 E2+NP 為加成效應，
E2+MXC 為擷抗效應，推測 NP 可能與 E2 經由相同的機制誘導 vitellogenin 生 成，而 MXC 則可能與 E2 誘導 vitellogenin 生成的機制不同。由以上文獻可知，
不同的反應終點或不同受測物種可能導致不同的混合效應，如 Arukwe et al.結 果顯示 NP 與 lindane (γ-HCH)混合甚至導致 Zrp 及 vitellogenin 擷抗反應；在 Thorpe et al.以 Vitellogenin 為反應終點，E2+NP 雖為加成效應，但 E2+MXC 則 產生擷抗作用，與本實驗兩種物質混合僅產生加成效應的結果不同，可能從不 測物質中，僅 17β-estradiol , bisphenol A , 4-nonylphenol , 4-tert-octylphenol 可誘 發轉錄活性(transactivation)，而且在相關參數 ligand efficiency 及 ligand potency 的分析，其中，相同的受測物對不同 isoform 的雌性激素受體 (ERα、ERβ)，
其參數亦顯示不同的結果，因此可知相同受測物在分子誘導機制上之不同，而 一般生物體除了有α form、