1.
結果我們分析 NCBI Gene Expression Omnibus（GEO）browser 當中關於 CB1 與 CB2 在各種癌症的數據中發現，在許多人類腫瘤組織或細胞中，CB1 及 CB2 的 表現量相對於正常細胞有增加的趨勢，其中又以大腸直腸癌中 CB1 及 CB2 表現 量增加最為突出。因此，我們預計以大腸直腸癌細胞株探討大麻類藥品對腫瘤細 胞之影響。NCBI GEO database 顯示，不論是原位或轉移性大腸直腸癌組織，其 CB1 與 CB2 表現都比正常腸細胞有增加的趨勢（Figure 1）。我們進一步分析 AOM/DSS 誘導大腸直腸癌的小鼠腸組織，以及利用 HCT116 大腸直腸癌尾靜脈 注射所建立的肺轉移小鼠模型，也觀察到 CB1 與 CB2 都比正常細胞有表現量增 加的趨勢（Figure 2）。這些結果顯示，CB1 和 CB2 可能在大腸直腸癌 tumorigenesis 過程中扮演重要角色。
於是我們進一步想探討Δ9-THC 是否會影響大腸直腸癌細胞的增生。MTT 結 果顯示，在生理劑量下Δ9-THC 不會影響大腸直腸癌細胞的 cell viability（Figure
3）
。經由 transwell migration assay 進一步發現，在不影響 cell viability 的 Δ9-THC 生理劑量之下，Δ9-THC 會明顯促進大腸直腸癌細胞爬行之能力（Figure 4）。接著我們想利用 xenograft mouse model 在 in vivo 中觀察Δ9-THC 對腫瘤生長 的影響。在Δ9-THC 的處理下，我們發現到Δ9-THC 能發揮已知增加食慾的效果 使得小鼠的飲食及飲水皆增加。我們更發現到Δ9-THC 會使得腫瘤生長得更好更 大顆（Figure 5）。我們將腫瘤組織切片染色分析後發現到Δ9-THC 會促進血管 新生的 marker（CD31、VEGF）表現量增加，而 VEGF 的表現更與腫瘤的大小 呈顯著的相關性（Figure 6）。我們也在另一種動物模型 HCT116 大腸直腸癌尾 靜脈注射所建立的肺轉移小鼠模型中觀察到一樣的現象，Δ9-THC 能夠促進腫瘤 的生長、促進血管新生。從這裡的結果我們可以推論出Δ9-THC 促進腫瘤生長與 其促進血管新生的效果有關（Figure 7 & 8）。
8
由於血管新生的作用來自於腫瘤細胞與內皮細胞交互作用的效果，進而促進 腫瘤的生長，因此我們便想在 in vitro 下透過 hiPSC-VECs 來探討Δ9-THC 如何 去影響到 hiPSC-VECs 與大腸直腸癌細胞間的交互作用(18)。我們收集了Δ9-THC 處理下的 HCT116 conditioned medium（HCT116 CM），發現到若將 hiPSC-VECs 處理 HCT116 CM，內皮細胞的血管新生能力及爬行能力的明顯的增加了，因此 推測Δ9-THC 可能透過促進 HCT116 分泌 growth factor 來影響到內皮細胞的生長 狀況。在分析了 HCT116 CM 後，我們發現到其中有五種 growth factors 的表現 量明顯增加，分別為 GDNF、IGFBP6、IGF2、SCF、VEGFA，而這些 growth factors 也確實調控了許多與細胞增生、代謝相關的訊息傳遞路徑。我們再利用 UCSC Genome Browser 進行分析，發現到了這五種 growth factors 的 promoter regions 上有共同的十一種 transcription factor binding sites。我們實驗後也發現到Δ9-THC 並不會影響到這十一種 transcription factors mRNA 的表現。在我們進一部探討 STAT1 時發現到，雖然 STAT1 的蛋白表現同樣不會受到Δ9-THC 的影響，但在 免疫螢光染色的結果卻發現到 STAT1 會受到Δ9-THC 的誘導下而由細胞質移動 到細胞核中並接合到這五種 growth factors 的 promoters 上（Figure 10）。
為了確定Δ9-THC 是透過 STAT1 來對這五種 growth factors 進行調控，我們 分別使用了 STAT1 antagonists（fludarabine）以及 CRISPR/Cas9 的技術抑制 STAT1 的作用，來觀察這五種 growth factors 的變化。在兩種的實驗方法下我們都觀察 到了 STAT1 受到抑制下，這五種 growth factors 的表現量即使在Δ9-THC 處理後 也沒有顯著的提升。這便說明了Δ9-THC 能透過 STAT1 來調控這五種 growth factors 的表現（Figure 11）。
最後，我們想確定Δ9-THC 是否是透過 STAT1 來對腫瘤細胞造成影響。我 們選擇了 xenograft mouse model 來進行 in vivo 的觀察，我們將 STAT1 wild type 以及 STAT1 knock out 的 HCT116 分別種在同一隻小鼠背部的兩側。在處理Δ
9-THC 之下，我們發現到在 STAT1 knock out 的腫瘤，腫瘤生長的現象非常明顯
的被抑制了。因此從本實驗我們推論Δ9-THC 能透過 STAT1 來促進腫瘤的生長
（Figure 12）。根據以上的結果所述，我們的結論為Δ9-THC 能夠透過 STAT1 的調控來促進血管新生以及腫瘤的生長。
Figure 2. IHC 染色分析 AOM/DSS 大腸直腸癌小鼠及肺臟轉移小鼠組織 CB1 與 CB2 之表現量。左圖：利用 AOM/DSS 誘導小鼠產生大腸直腸癌，再對大腸組織切 片進行 IHC，可發現到大腸直腸癌組織與健康腸組織相比下 CB1 及 CB2 的表現量 較高。右圖：我們在大腸直腸癌的肺轉移模式中，對肺部組織切片進行 IHC，同樣 觀察到相較於健康肺泡組織，其 CB1 及 CB2 的表現量較高。
Figure 1. NCBI GEO 資料庫數據分析結果。左圖：將資料庫的數據加以整理可 發現到在大腸直腸癌中腫瘤組織及正常組織相比下腫瘤組織 CB1 及 CB2 的 mRNA 表現量皆較高。右圖：將資料庫的數據加以整理可發現到在兩類不同的 轉移型大腸直腸癌（Synchronous metastases、Metachronous metastases）中，兩 者 CB1 及 CB2 mRNA 的表現量相較於 primary tumor site 皆更為豐富。
10
Figure 3.不同濃度Δ9-THC 評估對大腸直腸癌腫瘤細胞存活率之影響。選用三株大 腸直腸癌細胞株（HCT116、SW480、RKO）在不同濃度下的Δ9-THC 來進行 MTT assay。我們觀察到在 5μM 及 10μM 的濃度下不影響到細胞株的 viability，且為臨 床治療的濃度，因此我們便選擇 5μM 及 10μM 的濃度來作為後續的實驗劑量。
Figure 4.不同濃度Δ9-THC 評估對大腸直腸癌腫瘤細胞爬行能力之影響。利用(A) transwell migration assay 及(B) wound healing assay 觀察到大腸直腸癌細胞在Δ9-THC 的誘導下會 dose-dependently 促進腫瘤細胞的爬行能力。
A
B
B A
C
B
A C
Figure 5. 利用 xenograft mouse model 觀察 Δ9-THC 對腫瘤生長的影響。(A) xenograft mouse model 及Δ9-THC 處理之 protocol。(B)Δ9-THC 處理下小鼠的飲食 及飲水皆增加。(C) Δ9-THC 處理使得腫瘤長得更大顆。
Figure 6. IHC 染色分析 Δ9-THC 在 xenograft mouse model 中對腫瘤血管新生的影 響。(A & B) Δ9-THC 的誘導下使得腫瘤組織中血管新生的 marker (CD31、VEGF) 表 現量增加。(C) 腫瘤組織的大小與腫瘤組織中 VEGF 的表現量呈顯著正相關性。
12 A B
C
A B
C
Figure 7. 利用 IVIS 觀察 Δ9-THC 在 CRC lung metastasis model 中 對腫瘤生長的影響。(A) CRC lung metastasis model 及Δ9-THC 處理之 protocol。(B) Δ9-THC 處理下小鼠 的 飲 食 及 飲 水 皆 增 加 。 (C) Δ
9-THC 處理 下造 成較大 的 tumor burden。
Figure 8. IHC 染色分析 Δ9-THC 在 CRC lung metastasis model 中對腫瘤血管新生的 影響。(A & B) Δ9-THC 的誘導下使得腫瘤組織中血管新生的 marker (CD31、VEGF) 表現量增加。(C) 腫瘤組織的大小與腫瘤組織中 VEGF 的表現量呈顯著正相關性。
A B
Figure 9. 觀察 Δ9-THC 處理下的 HCT116 CM 對 hiPSC-VEC 血管新 生及爬行的影響。(A) Δ9-THC 使得 HCT116 CM 促進 hiPSC-VEC 血 管新生的效果更顯著。(B) Δ9-THC 使得 HCT116 CM 促進 hiPSC-VEC 爬行的能力更顯著。
14 A
B
C D
Figure 10.透過分析 HCT116 CM、UCSC Genome Browser、CRC 之細胞實驗證實 STAT1 的變化。(A) Δ9-THC 使得 HCT116 CM 中的 growth factor 表現量增加(GDNF、
IGFBP6、IGF2、SCF、VEGFA)。(B)在 UCSC Genome Browser 中發現表現量增加的五 種 growth factor 之共同上游 transcription factor，其中包含 STAT 1。(C) 透過免疫螢光染 色觀察到Δ9-THC 能促進 HCT116 中 STAT 1 的入核。(D) 利用 ChIP assay 發現Δ9-THC 能促進 STAT1 接合到 promoters 上。
B A
A B
Figure 11.利用 STAT1antagonist(fludarabine)及 CRISPR/Cas9 knock out STAT1 觀 察 Δ9-THC 處 理 下 HCT116 CM 中 growth factors 的 變 化 。 (A) STAT1 antagonist(fludarabine)造成Δ9-THC 誘導之五種 growth factors 表現量顯著下降。(B) CRISPR/Cas9 knock out STAT1 造成Δ9-THC 誘導之五種 growth factors 表現量顯著下 降。
Figure 12.利用 xenograft mouse model 觀察 Δ9-THC 對 STAT1 knock out 後腫瘤生 長的影響。(A)xenograft mouse model 及Δ9-THC 處理之 protocol。(B) STAT1knock out 後的腫瘤對於Δ9-THC 的誘導效果顯著下降。
16 STAT1 為一個 tumor suppressor，然而近年來也有更多的證據指出 SAT1 也可能 為一個 tumor promoter(19, 20)。儘管 STAT1-STAT1 homodimers 或 STAT1-STAT2 heterodimers 堆積在細胞核內具有使腫瘤細胞生長停滯及細胞凋亡的效果，但在 許多癌症中能夠觀察到異常的 STAT1 活化，包括乳癌、間皮瘤、頭頸癌、淋巴 癌等。在其他研究中更是看到腫瘤細胞中若表現更多 STAT1 和/或
phospho-STAT1 將導致較差的預後(21, 22)。在本次的研究中，我們則觀察到了Δ
9-THC 能透過調控 STAT1 的入核來促進大腸直腸癌細胞的生長及血管新生，而
在我們給予 STAT1 antagonist 下則觀察到Δ9-THC 對於腫瘤細胞的誘導效果便明 顯受到抑制，這表示了 STAT1 在Δ9-THC 對於腫瘤細胞的誘導效應中非常重要。
3.
結論本研究發現到Δ9-THC 能透過調控 STAT1 的入核來促進大腸直腸癌細胞的 生長及血管新生。我們也能透過給予 STAT1 antagonist 來減少Δ9-THC 對於 growth factors 的誘導效果，便更進一步阻斷腫瘤細胞與內皮細胞間的交互作用。
我們的研究成果能夠建議臨床上在使用大麻類藥物時若能併用 STAT1 antagonist，
則可減少掉大麻類藥物造成腫瘤生長以及血管新生的負面效果。
18
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研究相關發表
1.
期刊論文：本研究成果目前已經撰寫成 manuscript 進行投稿 (Cannabinoids orchestrate cross-talk between cancer cells and endothelial cells in colorectal cancer, Manuscript under revision，共同作者。2. 研討會論文：大麻相關研究成果於 2020 年 11 月 8 日由「台灣藥學會/台灣 臨床藥學會」舉辦的『第二屆台灣藥學聯合學術研討年會』獲選口頭報告 (口頭報告編號：#0131)，報告人：林文嵃。
3. 科普文章：於「台大景福醫訊」發表參與『第二屆台灣藥學聯合學術研討
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