本實驗室在先前已經探討 Pseudomonas sp.的菌種特性及苯甲酸轉換成己 二烯二酸的代謝能力，另一方面亦對培養基進行最適化及氧氣質傳對系統所 造成的影響之探討，並找出苯甲酸、酵母萃取粉、琥珀酸作為最佳複合營養 源的饋料組合，最後找到了培養基的最佳碳氮比為 1(葡萄糖 10 g/L、酵母萃 取粉 10 g/L)，使得菌體量的比生長速率 0.63 hr
-1
、生產力 1.42 g/L/hr、單位菌 體轉化率 0.86 g MA/g DCW/hr 皆有明顯的提高，將有助於增加己二烯二酸累 積的速率(劉, 2013)。前人研究得知，利用調控饋料和周期饋料的方式做比較，相較於周期饋 料，在調控饋料的方式下，比生長速率和生產力有較明顯的提升(劉, 2013)。
因此，吾人將延續前人研究之成果，繼續利用調控饋料作探討，藉由改變不 同的苯甲酸、酵母萃取粉、琥珀酸的饋料濃度，比
較菌體比生長速率
及生產力 的差別；為了減少工業化的成本，在找到最佳饋料濃度後，將通氣氣體由氧 氣改成空氣，探討其對系統中己二烯二酸累積速率的影響；最後再利用 20 L 氣舉式醱酵槽和 200 L 的攪拌式醱酵槽進行規模放大，比較不同醱酵槽對於 系統的影響。4-1 饋料期間，苯甲酸濃度對己二烯二酸生成之影響
本實驗是藉由 Pseudomonas sp.轉換苯甲酸來生成己二烯二酸的醱酵系統，
苯甲酸在醱酵系統中扮演重要的反應物角色，但因苯甲酸屬芳香族的一種，
對微生物有強烈的毒性，因此使一般微生物難以利用而無法生存，所以常被 當作食品防腐劑使用。為了探討饋料期間，苯甲酸濃度對己二烯二酸醱酵的 影響，實驗設計為分別將醱酵系統中的苯甲酸濃度維持在低濃度(以苯甲酸在 饋料過程不累積作為判別的依據，如圖 4-1(A))及 1 g/L(如圖 4-1(B)的饋料方
33
式)，比較兩種濃度對菌體比生長速率及己二烯二酸累積速率之影響。實驗條 件為通入氧氣，實驗培養基的碳氮比為 1(葡萄糖 10 g/L、酵母萃取粉 10 g/L)，
當系統中苯甲酸與琥珀酸消耗完時，饋入苯甲酸、酵母萃取粉、琥珀酸。
(A) (B) 圖 4-1 苯甲酸饋料濃度示意圖 (A) 饋料期間，將苯甲酸調控在低濃度 (B) 饋料期間，將苯甲酸維持約 1 g/L 的濃度
由兩種苯甲酸饋料濃度條件對於己二烯二酸醱酵的實驗結果可以發現，
維持在低濃度苯甲酸及 1 g/L 苯甲酸的醱酵最終產物己二烯二酸濃度分別為 22 g/L 及 18 g/L，如圖 4-2，表示在醱酵過程中將苯甲酸維持在低濃度下，對 於產物的回饋抑制是有影響的。相較於濃度 1 g/L 的苯甲酸，若能將苯甲酸控 制在低濃度不累積的環境下，則可得到較多的己二烯二酸生成量，此結果可 能是與低濃度的苯甲酸對於菌體生長的抑制影響較小有關，因苯甲酸本身屬 防腐劑的一種，當其濃度未到達可抑制菌體生長的臨界值時，就使菌體量較 濃度 1 g/L 的苯甲酸來得多，因此可增加己二烯二酸的累積速率。將維持 1 g/L 和低濃度苯甲酸等兩種不同饋料方式所得的菌體生長量及產物累積量的歷時 圖分別進行比較，如圖 4-2 及圖 4-3，由實驗歷時圖可以看出，兩種不同的饋
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
0 1 2 3 4 5 6
BA Concentration
Time(hr)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
0 1 2 3 4 5 6
BA Concentration
Time(hr)
34
料濃度對於菌體的比生長速率和產物的累積速率有顯著的差異。實驗皆於第 6 小時開始饋料，而以維持 1 g/L 的苯甲酸濃度為對照組，從表 4-1 所示，結果 顯示低濃度苯甲酸的生長速率相較於對照組提升了 40%；而菌體生產力則提 升了 18%。
苯甲酸在系統中扮演著反應物的角色，但是在醱酵過程中，系統中苯甲 酸濃度如果過高，易造成菌體生長延緩，使得菌體對苯甲酸的消耗速率連帶 受到影響，將苯甲酸有效的控制在低濃度下，可有助於改善過量苯甲酸會抑 制菌體生長代謝的問題，實驗歷時圖於附錄一。
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
3.5
Control BA conc. at minimum level Control BA conc. around 1 g/L
D C W( g /L)
Time(hr)
圖 4-2 苯甲酸濃度維持 1 g/L 與低濃度對菌體量生長之比較
35
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Control BA conc. at minimum level Control BA conc. around 1 g/L
M A (g /L)
Time(hr)
圖 4-3 苯甲酸維持在低濃度及維持 1 g/L 對己二烯二酸生成之比較
表 4-1 苯甲酸饋料濃度對醱酵系統參數之比較
BA conc. μ(hr
-1
) P(g MA/L/hr) Ultimate MA Conc. (g/L)低濃度 0.084 1.32 22
維持 1 g/L 0.06 1.12 18
4-2 饋料期間，酵母萃取粉濃度對己二烯二酸生成之影響
在微生物醱酵實驗中，除了添加反應物轉化為產物之外，也需要添加碳 源及氮源來維持微生物正常生長所需的能量。氮源主要可作為微生物中蛋白 質、胺基酸、核酸的來源，在醱酵實驗中也可用來提升微生物的生長速率。
一般氮源可以分為兩類:有機氮源及無機氮源，兩者常一起搭配使用，在醱酵 初期，無機氮源較容易被微生物利用；到了中後期，由於為生物體內的酵素 已成形，故開始利用有機氮源。為了可以得到更多的己二烯二酸，吾人使用
36
了饋料批式的方式，在醱酵的過程中，於初始培養基的營養源快消耗完畢時 進行氮源的添加，由於生物體內的酵素已活化，所以選用有機氮源-酵母萃取 粉在第六個小時進行添加的動作如圖 4-4。在饋料實驗中，初始培養基碳氮比 為 1(葡萄糖 10 g/L、酵母萃取粉 10 g/L)，培養條件為起始 pH 值 7.5、溫度 28
℃，第六小時開始進行饋料，苯甲酸維持低濃度、琥珀酸全程維持 3 g/hr，再 分別改變酵母萃取粉的饋料速率(3 g/hr、4 g/hr、5 g/hr、6 g/hr)，控制組為饋 料時期不添加酵母萃取粉並探討其影響。
由圖 4-5 及圖 4-6 可以發現，在饋料期間給予不同的酵母萃取粉的饋料 速率，有利於 Pseudomonas sp.的細胞累積，從比生長速率和菌體生長量的趨 勢來看，其對苯甲酸的轉換能力都有明顯的幫助。圖 4-7 表示，饋料期間系 統的含氮量，當饋料速率達 6 g/hr 時，系統中的不可醱酵氮逐漸的累積。而 表 4-2 顯示隨著酵母萃取粉的速率增加，菌體的轉化率、己二烯二酸的生產 力和菌體的平均生產力也有增加的趨勢，其中又以 5 g/hr 的饋料速率的比生 長速率為 0.1 hr
-1
、產率達 47%、生產力 1.36 g MA/L/hr 與單位菌體量 2.46g MA/g DCW/hr，與饋料期間未添加酵母萃取粉的數據做比較，分別提高了 480%比生長速率、23%的產率、72%的己二烯二酸生產力及 35%的單位菌體 平均生產力，同時也證明了 Pseudomonas sp.在生產己二烯二酸時，酵母萃取 粉扮演著重要的角色，實驗歷時圖於附錄二。37
Benzoate(BA, g/L) Succinic acid(SA, g/L) pH
DCW(g/L)
Muconic acid(MA, g/L)
pH SA BA DCW MA
Time (hr)
6 g/hr Fed-batch stage
Batch stage
38
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
M u co n ic A ci d ( g /L)
Time(hr)
6 g/hr 5 g/hr 4 g/hr 3 g/hr 0 g/hr
圖 4-6 酵母萃取粉饋料速率對己二烯二酸生成之比較
6 9 12 15 18 21
0 20 40 60 80
To tal N ir o g en (mg /L)
Time(hr)
6 g/hr 5 g/hr 4 g/hr 3 g/hr 0 g/hr
圖 4-7 醱酵系統中之總氮量比較
39
表 4-2 酵母萃取粉饋料模式對醱酵系統參數之比較 YE
Feeding Rate (g/hr)
Y(%)
P
6-16
(g/L/hr)
Ultimate MA Conc.(g/L)
CP
avg,6-16
(g MA/g DCW/hr)
μ(hr
-1
)0 38±2.2 0.79±0.07 13.65±0.8 1.82±0.06 0.017
6-10
3 39±1.4 1.12±0.02 15.33±0.7 2.01±0.01 0.07
6-14
4 44±1.4 1.23±0.04 18.02±0.8 2.21±0.08 0.086-14
5 47±0.7 1.36±0.08 21.46±0.4 2.46±0.07 0.10
6-16
6 45±0.6 1.36±0.11 22.21±1.3 2.23±0.12 0.086-16
※下標表示之醱酵時段，如 P
6-16
表示第 6 小時-第 16 小時之生產力。4-3 饋料期間，琥珀酸濃度對己二烯二酸生成之影響
有機酸在微生物醱酵製程上可當作主要碳源，亦可提供微生物生長時所 需的能量，或者當作輔碳源幫助微生物維持生理的基本機能，所以說在醱酵 實驗中添加適量的有機酸能有助於微生物生長和提高產物累積濃度及效率。
而在本實驗中所添加的琥珀酸可藉由回補作用(Anaplerotic reactions)使微生物 在代謝途徑中產生的中間產物保持穩定。本實驗室使用了一株能代謝芳香族 化合物的原始菌株，其在代謝過程可產生有機酸而對 TCA cycle 進行回補作 用，使得原用以維持微生物正常生理運作的中間產物獲得補充，而不因作為 其他用途而影響微生物生長。
突變後經由篩選取得高己二烯二酸產率的菌株 Pseudomonas sp.，藉由突 變來改變原本在代謝路徑表現的基因，而獲得大量己二烯二酸的累積，另一 方面也表示著原本代謝路徑用來產生有機酸，進行回補作用的微生物生理機 制亦受到影響，故在此醱酵系統中琥珀酸扮演著補充 TCA cycle 中間產物的
40
角色，因而可維持微生物的正常生理運作。但添加高濃度的琥珀酸則會破壞 原本回補作用所維持的中間產物恆定的生理機制，進而會影響菌體增殖及產 物的累積效率。
本節主要在探討不同的琥珀酸濃度對己二烯二酸醱酵的影響，研究輔碳 源對菌體生長和產物累積的影響。在饋料實驗中初始培養基碳氮比為 1(葡萄 糖 10 g/L、酵母萃取粉 10 g/L)，培養條件為起始 pH 值 7.5、溫度 28℃，第六 小時開始進行饋料，苯甲酸維持低濃度、酵母萃取粉維持 5 g/hr，而琥珀酸分 別維持(不添加、1 g/hr、3 g/hr、6 g/hr)，另外針對產物回饋抑制做了兩階段，
第一階段為在產物回饋抑制前，分別添加 9 g/hr 與 11 g/hr 的琥珀酸進行試驗，
第二階段為當己二烯二酸累積到 11 g/L 左右的時候改為添加 1 g/hr，此目的為 維持醱酵系統中的基本碳源能量，以琥珀酸 3 g/hr 為控制組，來探討這六種 饋料方式對己二烯二酸產物累積的影響，饋料方式如表 4-3。
由圖 4-8 及圖 4-9 可以看出，隨著琥珀酸饋料速率的增加，單位菌體的 生產力也跟著提高，前人實驗中有提到(劉, 2012)，當饋料過程中己二烯二酸 的濃度達 11 g/L 的時候，己二烯二酸就會開始抑制 Pseudomonas sp.對苯甲酸 的轉化能力和菌體的代謝的能力，使得琥珀酸造成累積而間接影響整個醱酵 系統，圖 4-10，全程饋 6 g/hr 的琥珀酸，在己二烯二酸累積到 11 g/L 的時候 開始累積，所以吾人將饋料方式利用兩階段不同速率的饋料方式，醱酵過程 中琥珀酸的總克數可以分為兩類，分別為 55 g 與 65 g。在表 4-4 及表 4-5 可 以發現，全程維持 3 g/hr 與前期饋 9 g/hr，10 hr 後改饋 1 g/hr，兩者琥珀酸總 重都是 55 g。但是推論前期添加大量的琥珀酸，在菌體對數成長期的時候，
可利用回補作用，補足 TCA cycle 裡菌體所需要維持的生理機能的能量，而 當己二烯二酸累積至抑制濃度時，便無法消耗大量的琥珀酸，改為低濃度的 琥珀酸，僅提供菌體基本氮源消耗。使得菌體在代謝苯甲酸的時候，可順利
41
的將己二烯二酸的生產力達到 2 g/L/hr 和高達 55%的產率和全程維持 3 g/hr 累積己二烯二酸的生產力達到 2 g/L/hr 和 47%的產率，分別提高了 48%和 17%。
前期饋 9 g/hr，10 hr 後改饋 1 g/hr(總克數 55 g)和全程維持 6 g/hr(總克數 65 g) 來比較，可以看出參數的數據並無明顯差異，所以選用較低成本的饋料方式，
前期饋 9 g/hr，10 hr 後改饋 1 g/hr(總克數 55 g)和全程維持 6 g/hr(總克數 65 g) 來比較，可以看出參數的數據並無明顯差異，所以選用較低成本的饋料方式，