5-1
己二烯二酸鑑定與定性確認
在進行製程優化前，需先行確認此菌株會大量生產並累積己二烯二酸，為此 我們使用不同的儀器分析方法，以確定菌株所生產的細胞代謝物為己二烯二酸，
運 用 的 儀 器 有 HPLC 、 UV/VIS 、 IR 、 LC-MS ， 測 量 醱 酵 產 物 與 標 準 品 (trans,trans-muconic acid)。
因醱酵液中含有大量雜質，要測量醱酵液內的己二烯二酸，需先經過純化，
以免受到雜質干擾不易判讀結果。己二烯二酸為一酸類，醱酵液平均pH 值為 8，
會使己二烯二酸溶於其中形成離子，因此將醱酵液酸化使之沉澱，經由測試pH 1.5 以下可得之。將沉澱物分離出來後用甲醇回溶，除去不溶物後利用HPLC 分析，
得知沉澱物內含己二烯二酸總量為原始醱酵液中的 82.5 ％，換算出回溶後的溶 液中己二烯二酸重量，比較將溶液乾燥後的乾重，得知其中己二烯二酸占60 ％，
於儀器中已可明顯分辨己二烯二酸波峰。
因己二烯二酸在UV260 nm 有強烈吸收峰，而 HPLC 具有定量準確度高的特 性，於是實驗結果皆利用HPLC 進行分析定量，確定最終醱酵液中含大量己二烯 二酸，且基質苯甲酸與中間產物鄰苯二酚皆有消耗完畢(圖 5-1)，且在 UV/VIS 吸 光檢測中確認標準品與醱酵液圖譜在UV260 nm 有一致吸收峰，如圖 5-2 所示。
IR 的原理是利用化合物某些官能基會吸收特定波長的紅外線藉以偵測化合 物的結構，在 FTIR 的分析中進一步確認了官能基標準品與醱酵液有一致的吸收 帶，且-OH、-C=O、-C=C 的吸收峰確實符合在資料庫中的己二烯二酸圖譜，如 圖5-3 所示。
28
LC-MS 的偵測極限低且敏感度高，在 LC-MS 的分析中同樣也確認了標準品 與純化後的醱酵液中有一致的最大波峰(圖 5-4)，由觀察下方裂解圖譜，可發現有 大量分子量143 之片段，證明兩者具有一致的分子結構，後段些許雜質則視為管 柱殘留物，由此確認了在醱酵過程中大量累積的代謝物，確為我們所需求的產品
－己二烯二酸。
Muconate (4.25min)
Benzoate (6.84min)
Catechol (8.7min)
) A
Muconate (4.25min)
B)
圖5-1 HPLC-UV260nm 吸光檢測圖譜(A)標準品(B)醱酵液酸化沉澱物
29
● 己二烯二酸標準品 ■ 酸化後沉澱物
圖5-2 標準品與醱酵液酸化後沉澱物 UV/VIS 吸光檢測圖譜
30
31
32
5-2
前培養與己二烯二酸代謝之影響
醱酵程序在醱酵槽中進行，不但有節省空間以進行大量生產的優點，還能更 容易的測知醱酵液狀態，並調控之。放大生產需經由階段性的規模放大而得，接 菌量通常占總醱酵體積 1/10，前培養菌體的狀態對後期的醱酵反應有深遠的影 響，因此本節旨在探討在 5L 醱酵槽中(通入 1 vvm 空氣，轉速 300 rpm)前培養對 3 L 醱酵液之主培養影響。
5-2-1 前培養中不同培養基成分與濃度對菌體代謝己二烯二酸的影響
前培養成分對主培養的影響，除了因為前培養營養濃度或成分之不同會造成 接菌量或菌體活性差異外，如前培養的基質成分和醱酵槽中基質的成分差異過 大，有可能會使菌株適應期增長，造成整體醱酵時間的延長，因此本實驗首先探 討，前培養營養成分對主培養醱酵過程的影響。
前培養基質所使用的成分有兩種(見表 4-4)：基礎培養基為平板培養基的營養 成分，可活化菌株；最適化培養基為經由最適化策略調整後的營養成分，也是醱 酵槽中所採用的培養基成分。分別將用此兩種成分作為前培養的培養基，探討對 主培養的影響，前培養接入主培養時間設為14 hr。兩者的搖瓶醱酵曲線見圖 5-5，
利用基礎培養基之前培養在接菌時除剩餘的培養基質較多，兩者於14hr 測量的菌 體量比約1：7，接菌時數據整理於表 5-1。
33
muconic acid, benzoate (g/L)
Time (hr) 歷時圖(BA：benzoate, MA：muconic acid, DCW：dry cell weight)
表5-1 於 14 hr 時搖瓶中培養基成分濃度一覽表(BA：benzoate, MA：
muconic acid, DCW：dry cell weight)
BA(g/L) MA(g/L) DCW(g/L) pH
基礎培養基 0.39 0.93 0.08 7.2
最適化培養基 1.63 2.53 0.56 7.7
34
接入醱酵槽後，結果顯示使用基礎培養基為前培養的主醱酵中，菌體生長方 面，與最適化培養基為前培養者，對數生長期的比生長速率相同，但基礎前培養 的主醱酵初期約延遲兩小時才進入對數生長期，於10 hr 到達一定值(圖 5-6)。同 時生產己二烯二酸的速率也被影響，基礎培養基前培養己二烯二酸生產力僅0.132 g/L-hr，使用最適化培養基時可達 0.165 g/L-hr
，所以往後前培養條件將採用最適化的培養基。
Optimized Pre-cultivation BA Optimized Pre-cultivation MA Basal Pre-cultivation BA Basal Pre-cultivation MA
0.0
Optimized Pre-cultivation DCW
Basal Pre-cultivation DCW
圖5-6 前培養採用基礎培養基或最適化培養基時，醱酵槽中的菌體、產物、基 質歷時圖(BA：benzoate, MA：muconic acid, DCW：dry cell weight)(醱酵條件：通 空氣量1 vvm，轉速 300 rpm，kLa 200hr-1)
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5-2-2 不同前培養時數對菌體代謝己二烯二酸的影響
處於對數生長期的菌株，接菌後通常可以立即開始生長增殖。前培養時間過 短，菌體的不足將使醱酵前期生產菌體的時間拉長；若前培養時間過長，菌體已 進入停滯期或死滅期，則菌體的代謝活性己經轉弱，必須以更多的時間來適應新 的培養環境，搖瓶中生長曲線可見圖 5-5，接菌時期的細胞活性與當下培養基中 基質濃度整理於表5-2。
為確認前培養的醱酵時數對醱酵槽中的菌體己二烯二酸生產速率的影響，並 考慮到多組實驗的時間性，為節省時間與成本，以 10 ％接菌量，利用搖瓶測試 在不同前培養時數下後的醱酵，菌體與產物代謝之結果見圖 5-7,5-8。
主培養中己二烯二酸的生產速率整理於表5-3，當前培養時數為 14hr 時，可 得最高之己二烯二酸生產速率。雖然因更多的前培養時間，擁有較高接菌量，但 菌種的代謝活性較低，所能得到最終己二烯二酸濃度也較低，因此決定取醱酵效 率最高的14 小時作為醱酵槽前培養時數。
表5-2 於圖 5-5 之標準曲線中，不同前培養時數下，搖瓶內醱酵液成分 (BA：benzoate, MA：muconic acid, DCW：dry cell weight)
時間 (hr) 8 12 14 20
DCW(g/L) 0.25 0.52 0.55 0.72
MA(g/L) 0.33 1.49 2.53 3.63
BA(g/L) 4.52 3.16 1.63 0
(
g product/g cells/hr)
0.17 0.24 0.33 0.2536
0 5 10 15 20 25
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Muconic acid (g/L)
Tim e(hr) 8hr---0.24
12hr--0.52 14hr--0.55 20hr--0.72
圖5-7 不同前培養時間對主培養中己二烯二酸(搖瓶)之生長曲線(前培養時數—
接菌時DCW 值)
37
0 5 10 15 20 25
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
DCW(g/L)
Time(hr)
8hr---0.25 12hr--0.52 14hr--0.55 20hr--0.72
圖5-8 不同前培養時間對主培養中搖瓶菌體之生長曲線(前培養時數—接菌時 DCW 值)
表 5-3 不同前培養時數對主培養(搖瓶)己二烯二酸的生產速率
接菌時間 (hr) 8 12 14 20
0.176 0.2 0.255 0.22
(g product/g cells/hr) 0.3 0.35 0.44 0.38
38
39
時效率較高，葡萄糖可視為菌體成長之第一碳源，而琥珀酸為
，琥珀酸消耗速率將會提升。由此可知，葡萄糖 為生產菌體量之最佳碳源，高氧氣濃度有利於轉化，琥珀酸則為輔助基質，與氧 氣濃度無相關。
圖5-10 中，可看出苯甲酸與菌體量相關性低，但顯示苯甲酸與己二烯二酸 的生產成正相關，己二烯二酸的生產速率即相當於苯甲酸的消耗速率，由此可知 於醱酵過程中，苯甲酸是主要代謝成己二烯二酸的基質。
表5-4 各醱酵條件下，基質轉化產物效率一覽(x:菌體量、s:琥珀酸、g:葡萄糖、
b:苯 二酸)
vvm下，醱酵轉速維持於 300 rpm。圖 5-10 中可判別菌體量(x)、琥珀酸(s)、葡萄 糖(g)、苯甲酸(b) 、己二烯二酸(m)之間的相關度，並於表 5-4 得知，菌體量由消 耗葡萄糖進行生成
第二碳源；當葡萄糖不被添加時
5-3-3 苯甲酸 自
甲酸、m:己二烯
條件 Y(x/g) Y(x/s) Y(m/b)
air-300rpm-1vvm 0.1609 0.1851 0.6244 air-300rpm-3vvm 0.3247 0.1551 0.6814 O2-300rpm-1vvm 0.343 0.2021 0.6493 O2-300rpm-3vvm 0.4425 0.1911 0.6983
40
Muconic acid,benzoate,Succinic acid (g/L)
Time(hr)
no-glu MA no-glu BA no-glu succ 1.5g glu MA
benzoate, succ：succinic acid, DCW：dry cell weight)
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圖5-10 在 3L的醱酵槽中培養時，菌體量、己二烯二酸與各基質消耗量的關係 (a31：air-300 rpm-1 vvm、a43：air-450 rpm-3 vvm、o31：O2-300 rpm-1 vvm、o33：
O2-300 rpm-3 vvm)
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5-4
氧氣質傳和菌體代謝己二烯二酸關係
實驗菌株無論於細胞生長或酵素代謝均須耗費氧氣，但不了解醱酵系統中氧 氣質傳對兩者的影響程度，因此本實驗旨在求知氧氣質傳與己二烯二酸醱酵之間 的交互關係。
於圖 5-9 中顯示，以葡萄糖為限制基質的情況下，菌體量明顯減少，但與相 同通氣與攪拌條件下的己二烯二酸生產速率，並無顯著差異。因實驗菌株為好氧 菌，故改以氧氣質傳為限制基質，主培養中的基質成份與濃度均相同，攪拌速率 皆為300 rpm，但改變不同之通氣量 1 vvm(kLa=220 hr-1)、3 vvm(kLa=360 hr-1)，
見圖5-11；於特定基質被限制的情形下，菌體量明顯產量較少，己二烯二酸產率 也有明顯差距。由於同樣菌體濃度低的情況下 (如圖 5-9、圖 5-11)，己二烯二酸 產率顯然與氧氣關聯性較大，由此推測當主醱酵培養基充足時，菌體量的生產和 己二烯二酸生產之間沒有關聯性；但當氧氣被限制供給時，細胞會將氧氣利用於 細胞生成上，使得生產己二烯二酸的酵素反應速率下降，導致產率降低，由於好 氧性醱酵反應中，溶氧通常是反應限制基質，於是此後探討如何增進氧氣質傳，
使醱酵系統提供充足的氧氣傳遞。
5-4-1 氧氣質傳速率(kLa)
本實驗使用菌株為 Pseudomonas sp.，屬於好氧菌屬，欲使此類菌快速生長以 防止酵素活性被抑制，就必須要供應足夠的氧氣。充足的氧氣由通氣種類、控制 通氣量與攪拌速率來調整，來改變醱酵液中的溶氧量。因氧氣在水中溶解度不 高，在好氧醱酵反應中容易成為反應限制基質，尤其如需高菌體濃度下進行醱酵 時，菌體耗氧速率大於溶氧質傳速率，將會使醱酵在低溶氧狀態下進行。在單純 高轉速或高通氧量的情況下，有機會可提升氧氣質傳；但如無限增加通氣量或攪 拌速率，則有造成細胞被破碎或成本浪費的疑慮，因此需找尋一最適當的溶氧條 件。
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容積氧氣質傳係數(volumetric oxygen transfer coefficient, kLa)為描述氧氣溶 入液體中的速率，數值越大，指氧氣越容易進入溶液中，醱酵槽內溶液在特定條 件下的kLa值，測定方法如 4-5-4 所述，此數值可判斷於醱酵過程中，當菌體消耗 掉氧氣，溶液中氧氣濃度的回升速率；傳輸速度越快，自然醱酵液中的氧會維持 在較高濃度下；相對kLa值小，氧氣被消耗的速率大於氧氣進入醱酵液的速率，
使醱酵液中含氧量不足，造成菌體無足夠氧可利用。於是實驗先行測知各條件下 的kLa值，以此數值判斷菌體最低kLa需求，與預測各醱酵條件下氧氣質傳是否充
使醱酵液中含氧量不足，造成菌體無足夠氧可利用。於是實驗先行測知各條件下 的kLa值，以此數值判斷菌體最低kLa需求，與預測各醱酵條件下氧氣質傳是否充