表 3 、臺灣南部地區菱角炭疽病之病害調查結果。
Table 3. The results of field investigation on anthracnose disease of water caltrop in southern Taiwan.
地點 菱角品種 病徵
官田隆本里有機農田 臺灣菱 葉片出現黑褐色斑點，嚴重時病斑癒合並枯萎 官田西庄里有機農田 臺灣菱 葉片出現黑褐色斑點，嚴重時病斑癒合並枯萎
圖 2、2014 年 9 月於官田區隆本里有機菱角田發生之菱角炭疽病葉片病徵。
Figure 2. Symptoms of anthracnose on water caltrop leaf at the organic field of Longben in September, 2014.
圖 3、2014 年 9 月於官田區隆本里有機菱角田發生之菱角炭疽病。
Figure 3. Anthracnose on water caltrop at the organic field of Longben in September, 2014.
二、臺灣菱菱角炭疽病之病原菌分離及初步鑑定
本研究使用組織塊分離法及稀釋分離法，將各樣區包括官田區隆本里有機菱 角田、官田區西庄里有機菱角田、麻豆區慣行菱角田之臺灣菱葉片進行病原分離，
結果如表 4、表 5 所示。獲得之真菌分離株，皆以炭疽病菌為主。
本項統計自官田區隆本里樣區典型菱角炭疽病病斑上，以組織分離法分得 11 株真菌分離株，其中 7 株為炭疽病菌；另以稀釋分離法分離出 4 株炭疽病菌，此 區所得分離株之編號皆以 GL 後加數字表示(如表 6)。而官田區西庄里樣區以組 織分離法共獲得 14 株真菌分離株，其中 7 株為炭疽病菌；以稀釋分離法則分離 出 3 株炭疽病菌，其編號皆以 GW 後加數字表示(如表 6)。自麻豆區慣行菱角田 以組織分離法亦分 5 株真菌分離株，其中 3 株為炭疽病菌，其編號為 MD 後加 數字表示(如表 6)。
表 4、臺灣南部臺灣菱炭疽病病株以組織分離法分離之結果。
Table 4. The fungi isolated from diseased water caltrop with anthracnose in southern Taiwan by tissue isolation method.
地點 分離樣本數 炭疽病菌分離率
官田隆本里有機菱角田 11 7/11(63%)
官田西庄里有機菱角田 14 7/14(50%)
麻豆慣行菱角田 5 3/5(60%)
表 5、臺灣南部臺灣菱以稀釋分離法分離之結果。
Table 5. The fungal isolates of anthracnose from water caltrop in southern Taiwan by dilution method.
地點 分離樣本數 炭疽病菌分離率
官田隆本里有機菱角田 7 4/7(57%)
官田西庄里有機菱角田 5 3/5(60%)
表 6、臺灣南部臺灣菱分離所得菱角炭疽病菌分離株及其來源。
Table 6. Fungal isolates ofanthracnose isolated from water caltrop in southern Taiwan.
分離株編號 分離地點 分離部位 菌株種類
GL11 官田區隆本里有機菱角田 葉片 Colletotrichum sp.
GW01 官田區西庄里有機菱角田 葉片 Colletotrichum sp.
GW02 官田區西庄里有機菱角田 葉片 Colletotrichum sp.
GW03 官田區西庄里有機菱角田 葉片 Colletotrichum sp.
GW04 官田區西庄里有機菱角田 葉片 Colletotrichum sp.
GW05 官田區西庄里有機菱角田 葉片 Colletotrichum sp.
GW06 官田區西庄里有機菱角田 葉片 Colletotrichum sp.
GW07 官田區西庄里有機菱角田 葉片 Colletotrichum sp.
GW08 官田區西庄里有機菱角田 葉片 Colletotrichum sp.
GW09 官田區西庄里有機菱角田 葉片 Colletotrichum sp.
GW10 官田區西庄里有機菱角田 葉片 Colletotrichum sp.
MD01 麻豆區慣行菱角田 葉片 Colletotrichum sp.
MD02 麻豆區慣行菱角田 葉片 Colletotrichum sp.
MD03 麻豆區慣行菱角田 葉片 Colletotrichum sp.
圖 4、菱角炭疽病病菌於 PDA 培養後產生之分生孢子。
Figure 4. The conidia of Colletotrichum sp. on PDA isolated from anthracnose disease of water caltrop in southern Taiwan.
25μm
三、臺灣菱炭疽病分離株之病原性測試 (一)供試健康臺灣菱之栽種
於 2014 年 6 月及 2015 年 6 月自臺南官田區友善大地農場各購入約 300 株 健康之臺灣菱，於臺大中非大樓頂樓陽台及臺大農場溫室各以 10 吋塑膠盆套袋 加水種植，並以花寶作為營養源，每週施肥一次。
(二)接種源之製備
本研究之分離株，均以 PDA 培養於光週期十二小時 25℃定溫生長箱中(培
養皿大小為 9 公分)，經培養 10 天後可於表面看到分生孢子堆形成，以無菌水將 孢子洗下，配製成濃度為 1x105 conidia/mL 之孢子懸浮液。
(三) 臺灣菱葉片以孢子懸浮液接種之試驗
本部分以解剖刀於臺灣菱葉片製造出傷口，而後噴灑濃度為 1x105/mL 之孢 子懸浮液做為接種源，並以無菌水做為對照組。接種後以塑膠夾鍊帶封保濕 12 小時，並於 12 小時後去除塑膠夾鏈袋避免日灼，經 10 天後觀察並計錄發病情 形，其結果如表 7 所示。此外，亦有測試無傷口接種，然而無傷口接種發病時間 較長(需 7-15 天)，這個部分證實植物受傷時，受傷處的糖分、有機營養會流出，
有助於孢子的發芽及侵入(Eckert & Ratnayake, 1994, Pandey et al., 1993)，故在後 續實驗皆使用葉片傷口接種法。
表 7、臺灣南部臺灣菱炭疽病菌分離株接種健康臺灣菱之結果。
Table 7. The inoculation result of major fungal isolates derived from anthracnose disease of water caltrop by wound inoculation method.
接種分離株 接種葉片數 葉片發病數 發病率(%)
圖 5、臺灣南部菱角炭疽病分離株 GL05 接種臺灣菱 15 天後之發病情形。
Figure 5. The symptom development of anthracnose disease of water caltrop after inoculation with isolate GL05 for 15 days.
(四)人工接種菱角炭疽病之病原再分離
取前項經解剖刀製造傷口，並以孢子懸浮液接種產生病徵之葉片，再以組織 塊分離法進行病原再分離。結果顯示所有自發病病徵再分離之分離株皆與原接種 源菌株相同，完成柯霍氏準則第四條。
四、菱角炭疽病分離株之鑑定
(一)菱角炭疽病菌 GL05 分離株之 DNA 片段之 PCR 增幅及 NS 序列分析
經確定菱角炭疽病菌之病原性，並在接種過程中得知各分離株之病原性皆相
似，且在 PDA 之生長形態及植株上產生之病徵無明顯差異，故取其中由組織分 離法而得之菌株 GL05 做為代表性菌株，以 NS 基因片段進行分子鑑定。經過 DNA 萃取，並利用 PCR 進行片段放大後，NS 序列分析及序列比對分析進行分 子生物學鑑定。利用引子對 NS1(forward)、NS6(reverse)進行 PCR，所得之電泳 圖如圖 6，得到大小約為 1500 bp 之 DNA 片段，經 NS1 端及 NS6 端序列分析得
7，將序列資料以 NCBI 網站之基因庫進行 Blast 比對，得到結果如表 8，可以看 到與基因庫中 6 個序列 100%相似，6 個序列分屬 Colletotrichum sp.、Colletotrichum gloeosporioides、Colletotrichum musae 三種真菌之基因，但經進一步以 Max Score
進行比對，發現與 Colletotrichum gloeosporioides. (Acession# FJ227900.1)在 Max Score 部分得到最高數值(1929)故認定菱角炭疽病菌 GL05 應為 Colletotrichum gloeosporioides.。
圖 6、菱角炭疽病菌分離株 GL05 以引子對 NS1/NS6 進行 PCR 增幅所得之 DNA 片段電泳圖。
Figure 6. Electrophoresis pattern of anthracnose isolate GL05 from water caltrop pathogen after PCR amplification with primer NS1 and NS6.
1500
bpGCTGCGAATGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTAC
Figure 7. DNA sequence of anthracnose isolate GL05 from water caltrop pathogen after PCR amplification with primer NS1 and NS6.
1
表 8、菱角炭疽病菌 GL05 以引子對 NS1/NS6 經 PCR 增幅所得之序列至 NCBI 網站基因庫比對之結果。
Table 8. The identification result of anthracnose isolate GL05 from water caltrop with its DNA sequence submitted to NCBI gene bank.
Accession Description Max score FJ227900.1 Colletotrichum
gloeosporioides. 1929 1929 100% 0 100%
EU375524.1 Colletotrichum sp. 1927 1927 99% 0 100%
DQ916151.1 Colletotrichum
gloeosporioides. 1927 1927 99% 0 100%
AJ301904.1 Colletotrichum
musae. 1927 1927 99% 0 100%
AJ301909.1 Colletotrichum
gloeosporioides. 1927 1927 99% 0 100%
AJ301908.1 Colletotrichum
gloeosporioides. 1927 1927 99% 0 100%
AJ301912.1 Colletotrichum
fragariae. 1921 1921 99% 0 99%
AJ301907.1 Colletotrichum
gloeosporioides. 1921 1921 99% 0 99%
圖 8、菱角炭疽病菌株 GL05 於葉上產生之分生孢子盤。
Figure 8. The acervulus of anthracnose isolates GL05 formed on leaf.
圖 9、菱角炭疽病 GL05 培養於 PDA 之菌落形態。(A)為正面觀，(B)為背面觀。
Figure 9. Cultural morphology of anthracnose isolate GL05 on PDA. (A) Front view, (B) Back view.
五、溫度對菱角炭疽病菌菌絲生長速度之影響
本試驗選擇 15、20、25、30、35℃共五種溫度，比較菱角炭疽病 GL05 在不 同溫度培養 5 天之菌絲長度。結果如表 9 所示，顯示菱角炭疽病在 25℃時生長 速度最快，隨著溫度上升或下降生長速度減緩。試驗溫度中又以 35℃時生長速 度最慢，而 15℃時生長速度雖緩慢，但仍有一定的生長能力。
表 9、菱角炭疽病菌株 GL05 於不同溫度下培養 5 天之菌絲生長長度。
Table 9.Mycelial growth of anthracnose isolate GL05 from water caltrop on PDA at different temperature for 5 days.
溫度(℃) 菌絲生長長度(cm) * 標準差
區 2014 年病害嚴重度做圖，結果如圖 12 及圖 14 所示，可以發現符合綜合因 子的時數頻率很高(共 54 小時)或是總降雨量很高(mm)，9 月即有病徵產生。
進行相關性分析後如表 11 所示，發現此區間之病害嚴重度與前一個月之綜合 條件時數最為相關，相關係數(r)為 0.9485；其次為前一月總降雨量，相關係 數為 0.9371。
2. 2015 年隆本里、西庄里流行病學分析：
2015 年結果如表 10、圖 11 所示，菱角炭疽病發生生態與 2014 年相似，
從調查的 7 至 8 月都沒有病害發生，9 月開始在田間記錄到菱角炭疽病發生，
嚴重度分別為隆本里 23%、西庄里 20.7%，10 月持續上升至 29.3%及 25.8％，
此後維持此嚴重度至 12 月。將嚴重度與當月氣象因子進行分析(分析方式同 2014 年)，結果如表 10 所示。
從表 10 中，可以看到 7 至 8 月之病害嚴重度之數值與前一個月之氣象因 子，如：適合發病溫度時數(24-28℃)、符合蒲式二級風力時數、降雨時數、
綜合因子之時數、月總降雨量可能相關，將綜合因子、月總降雨量與兩個樣 區 2015 年病害嚴重度做圖，結果如圖 13、15 所示，可以發現符合綜合因子 的時數頻率很高(共 75 小時)或是總降雨量很高(mm)，9 月即有病徵產生。進 行相關性分析後如表 11 所示，發現此區間之病害嚴重度與前一個月總降雨量 最為相關，相關係數(r)為 0.9297；其次為前一月之綜合條件時數，相關係數 為 0.9271。
表 10、2014 年與 2015 年兩期菱角炭疽病嚴重度調查數據與相關氣象因子。
Table 10. The anthracnose disease severity of water caltrop and meteorological factors from 2014 to 2015.
圖 10、臺南地區菱角炭疽病病於 2014 年 5 月至 12 月病勢發展曲線。
Figure 10. Monthly anthracnose disease severity of water caltrop investigated from May 2014 to December 2014 at Guan Tian, Tainan.
圖 11、臺南地區菱角炭疽病病於 2015 年 7 月至 12 月病勢發展曲線。
Figure 11. Monthly anthracnose disease severity of water caltrop investigated from July 2015 to December 2015 at Guan Tian, Tainan.
圖 12、2014 年 5 月至 12 月臺南官田地區隆本里與西庄里菱角炭疽病嚴重度與 符合發病溫度、蒲氏二級風力之降雨時數(綜合條件時數)分析。
Figure 12. Relationship between anthracnose disease severity of water caltrop and 3 meteorological factors investigated form May 2014 to December 2014 at Guan Tian, Tainan.
圖 13、2015 年 7 月至 11 月臺南官田地區隆本里與西庄里菱角炭疽病嚴重度與 符合發病溫度、蒲氏二級風力之降雨時數(綜合條件時數)分析。
Figure 13. Relationship between anthracnose disease severity of water caltrop and 3 meteorological factors investigated form July 2015 to November 2015 at Guan Tian, Tainan.
圖 14、2014 年 5 月至 12 月臺南官田地區隆本里與西庄里菱角炭疽病嚴重度與 月總降雨量間之相關。
Figure 14. Relationship between anthracnose disease severity of water caltrop and last-monthly rainfall investigated form May 2014 to December 2014 at Guan Tian, Tainan.
圖 15、2015 年 7 月至 11 月臺南官田地區隆本里與西庄里菱角炭疽病嚴重度與 月總降雨量分析間之相關。
Figure 15. Relationship between anthracnose disease severity of water caltrop and last-monthly rainfall investigated form July 2015 to November 2015 at Guan Tian, Tainan.
表 11、臺南官田地區菱角炭疽病嚴重度與官田地區前一月氣象資料之相關分析。
Table 11. The correlation between anthracnose disease severity of water caltrop and 3 meteorological factors in last month investigated at Guan Tian, Tainan.
前一月氣象因子 相關係數(r)
前一月氣象因子 相關係數(r)