T 細胞的活化受到極複雜而精密的調控，當 T 細胞受體和抗原結合，會啟動一連 串的訊息傳遞，而使得細胞核內活化相關的基因表現。近年來有愈來愈多研究指 出，轉接蛋白(adaptor protein) 在此過程中扮演相當重要的角色。轉接蛋白雖然 不具有酵素活性，但能做為支架(scaffold)而同時和多個訊息傳導分子結合，將訊 游基因。但是在我們的實驗中，表現 paxillin S2A 的 DO11.10 細胞之 calcium influx 只有約 15%的下降(An-yun Chan, unpublished data)，並不足以解釋為何 IL-2 的產 量會明顯下降，這也暗示可能 paxillin 是經由另一條和鈣離子不相關的途徑調控 NFAT 的活化。
除了 calcineurin 的活性，還有許多其他機制可調控 T 細胞活化後核內 NFAT 的
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量，包括 NFAT mRNA 的穩定性(stability) 或被轉譯(translation)的量，以及 NFAT 蛋白本身的穩定性等。但從我們西方點墨法的實驗結果，各種表現 paxillin 突變
但我們並沒有觀察到 NFATp 有累積在細胞質中(圖十)。因此，表現 paxillin S2A 的細胞究竟是經由抑制 NFAT 進核或是影響 NFAT 的穩定性而使細胞核內 NFAT
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再者，不論是表現 paxillin 突變株的 DO11.10 細胞或是基因轉殖小鼠，其中都含 有相當量的內生性(endogenous) paxillin。這些仍可被磷酸化的內生性 paxillin 可 能已經足夠維持 T 細胞黏附或移動的能力，所以我們無法觀察到明顯的差異。要 剔除鼠卻出現相反的 phenotype。NFATp 的基因剔除鼠產生 IL-4 的能力上升，且 IFN- 的分泌受到抑制，使其 T 細胞的分化偏向 TH2；在 NFATc 的基因剔除鼠中
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圖一、Paxillin 的結構與磷酸化位置，及其對生理功能的影響
(A) Paxillin 的結構 Paxillin 的 N 端含有五個 LD motif，C 端則由四個 LIM domain 組成，皆為蛋白質之間進行交互作用的區域。除最廣泛表現的α 型 之外，還有在第四個 LD motif 後插入一段胺基酸序列的 β 型及 γ型，以 及不同轉譯起始位置的 δ型。
(B) Paxillin 上有多個 serine 及 tyrosine 可被不同激酶磷酸化，進而影響其生理功 能。被磷酸化的 tyrosine 可和其他具有 SH2 domain 的蛋白結合，並傳遞訊息；
被磷酸化的 serine 則可能是藉著影響 paxillin 的構型而改變其 binding specificity。
(圖擷取自 Brown et al., 2004, Physiol. Rev. 84:1315)
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圖二、T 細胞活化的訊息傳遞
當 T 細胞受體( T cell receptor)辨認由抗原呈獻細胞所呈獻的組織相容抗原-抗原 胜肽複合體，會傳遞一活化訊息，使 CD45 將 Lck 去磷酸化，使 Lck 恢復活性。
Lck 在催化本身的磷酸化之後，可進一步磷酸化 CD3 及 Zap-70。Zap-70 可磷酸 化 LAT 及 Slp-76 等重要的轉接蛋白(adaptor protein)，將活化訊息傳遞給 PLC- 或 Ras 及 Rac 等 small G protein。Small G protein 可進而活化特定的 MAPK pathway，而啟動 c-fos 及 c-jun 的表現。PLC-活化之後則可催化 PIP2 分解產 生 DAG 和 IP3，前者可在細胞膜附近活化 PKC，而後者則是能使內質網是出鈣 離子以活化 calcineurin，將 NFAT 去磷酸化使其進入細胞核，並啟動 IL-2 基因 的表現。
(圖擷取自 Huse M, 2009, J Cell Sci 122:1269)
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圖三、T 細胞黏附(adhesion)的過程
T 細胞進入組織或淋巴結時需要和 high endothelial venules (HEVs) 交互作用。首 先 T 細胞藉著滾動和內皮細胞接觸，並靠著 selecting 形成不穩定的結合( rolling and tethering)。活化後的 T 細胞可利用 integrin 和內皮細胞緊密的黏附
(adhesion)，並被趨化激素(chemokine)吸引而滲入組織中(diepedesis) (圖擷取自 Kinashi et al., 2005, Nat. Rev. Immunol. 5:546)
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圖四、本實驗所使用之 paxillin 突變株示意簡圖
在本實驗中，我們將 paxillin 可被磷酸化的 serine 及 tyrosine 做點突變，藉由在 DO11.10 細胞及基因轉殖小鼠中表現這些 paxillin 突變株，研究 paxillin 之磷酸化 情形和其生理功能之相關性。
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圖五、表現 paxillin 雙磷酸化位置突變蛋白的 DO11.10 突變株在 anti-CD3 刺 激下，IL-2 的分泌較 YFP 對照組細胞減少。
DO11.10 突變株以固定於 96 凹槽培養盤的不同濃度 anti-CD3 活化 12 小時，收 集培養上清液。並測定其中 IL-2 的含量。與 YFP 對照組細胞相比，表現 JNK/p38MAPK 磷酸化位置突變蛋白(S178A/S85A)的細胞株，IL-2 分泌顯著減 少。而表現 paxillin 單一磷酸化位置突變蛋白的 DO11.10 突變株在 anti-CD3 刺 激下，分泌 IL-2 的情形和 YFP 對照組細胞相當。
(An-yun Chang, unpublished data)
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圖六、表現 paxillin 磷酸化位置突變蛋白的 DO11.10 突變株之黏附或移動的能 力並無顯著影響。
(A) 利用不同濃度之 TPA 或 biotin-anti-CD3 活化 DO11.10 細胞，觀察其黏附至 ICAM-I 的能力。表現 paxillin 突變蛋白的 DO11.10 細胞相較於對照組 YFP 細胞，其黏附至 ICAM-I 的比例並無明顯差距。
(B) 利用不同濃度之 SDF-1刺激 DO11.10 細胞，利用 transwell 培養盤觀察其移 動的能力。表現 paxillin 突變蛋白的 DO11.10 細胞相較於對照組 YFP 細胞，
其移動的比例並無明顯差距。
(An-yun Chang, unpublished data)
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圖七、在 DO11.10 細胞中建立 paxillin 突變株
(A) pGC-paxillin-myc-YFP 質體構築。pGC-YFP 反轉錄病毒載體全長 7.8 kb，
paxillin-myc 基因片段全長 1.7 kb。Paxillin-myc 由 multiple cloning site (MCS) 嵌入載體，由 5’ LTR 啟動 paxillin-myc 的表現。黃色螢光蛋白(YFP)的表現 由 IRES 啟動。
(B) 以帶有 paxillin 突變基因的反轉錄病毒感染 DO11.10 細胞株，篩選表現黃 色螢光蛋白的細胞。收集表現黃色螢光蛋白的細胞之細胞萃取液，以
anti-paxillin 抗體偵測外源表現的 paxillin。
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圖八、表現 paxillin 雙磷酸化位置突變蛋白的 DO11.10 突變株在 anti-CD3 及 anti-CD28 刺激下，IL-2 的分泌較 YFP 對照組細胞減少。
DO11.10 突變株以固定於 96 凹槽培養盤的不同濃度 anti-CD3 活化 12 小時，收 集培養上清液。並測定其中 IL-2 的含量。與 YFP 對照組細胞相比，表現 JNK/p38MAPK 磷酸化位置突變蛋白(S178A/S85A)的細胞株，IL-2 分泌顯著減 少。而表現其他 paxillin 磷酸化位置突變蛋白的 DO11.10 突變株在 anti-CD3 及 anti-CD28 刺激下，分泌 IL-2 的情形和 YFP 對照組細胞相當。
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圖九、表現 paxillin 雙磷酸化位置突變蛋白的 DO11.10 突變株在 anti-CD3 及 anti-CD28 刺激下，IL-2 的分泌較 YFP 對照組細胞減少。
DO11.10 突變株以固定於 96 凹槽培養盤的不同濃度 anti-CD3 活化 12 小時，收 集培養上清液。並測定其中 IL-2 的含量。與 YFP 對照組細胞相比，表現 JNK/p38MAPK 磷酸化位置突變蛋白(S178A/S85A)的細胞株，IL-2 分泌顯著減 少。而表現 paxillin FAK 磷酸化位置突變蛋白的 DO11.10 突變株在 anti-CD3 及 anti-CD28 刺激下，分泌 IL-2 的情形和 YFP 對照組細胞相當。
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圖十、利用西方點墨法分析 T 細胞活化後細胞核內外 NFATp 量之變化。
同時表現 p38/JNK 磷酸化位置 paxillin 突變株之細胞(S2A)，其核內 NFATp 明顯 減少，但在細胞質中 NFATp 的量則無明顯差異。表現單一磷酸化位置 paxillin 突 變株之細胞及表現 FAK 磷酸化位置 paxillin 突變株之細胞核內外 NFATp 的量皆 無明顯差異。
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圖十一、利用西方點墨法分析 T 細胞活化後細胞核內外 NFATc 量之變化。
同時表現 p38/JNK 磷酸化位置 paxillin 突變株之細胞(S2A)，其核內 NFATc 明顯 減少，但在細胞質中 NFATc 的量則無明顯差異。表現單一磷酸化位置 paxillin 突 變株之細胞及表現 FAK 磷酸化位置 paxillin 突變株之細胞核內外 NFATc 的量皆 無明顯差異。
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圖十二、表現 paxillin 磷酸化位置突變蛋白的 DO11.10 突變株之黏附至 fibronectin 的能力並無顯著差異。
利用不同濃度之 TPA 活化 DO11.10 細胞，觀察其黏附至 fibronectin 的能力。表 現 paxillin 突變蛋白的 DO11.10 細胞相較於對照組 YFP 細胞，其黏附至
fibronectin 的比例並無明顯差距。
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圖十三、表現 paxillin 磷酸化位置突變蛋白的 DO11.10 突變株之黏附至 fibronectin 的能力並無顯著差異。
利用不同濃度之 anti-CD3 活化 DO11.10 細胞，觀察其黏附至 fibronectin 的能力。
表現 paxillin 突變蛋白的 DO11.10 細胞相較於對照組 YFP 細胞，其黏附至 fibronectin 的比例並無明顯差距。
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圖十四、表現 paxillin FAK 磷酸化位置突變蛋白的 DO11.10 突變株之移動的能 力受到抑制。
利用不同濃度之 SDF-1刺激 DO11.10 細胞，利用 transwell 培養盤觀察其移動 的能力。表現 paxillin FAK 磷酸化位置突變蛋白的 DO11.10 細胞相較於對照組 YFP 細胞，其移動的比例降低，但表現 JNK/p38 磷酸化位置突變蛋白的組別則 無明顯差距。
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圖十五、表現 paxillin 雙磷酸化位置突變蛋白的 DO11.10 突變株和 B 細胞株之 結合並無顯著差異。
(A) 表現不同的 paxillin 雙磷酸化位置突變蛋白之 T 細胞和 B 細胞株 A20，在 有無 OVA 胜肽的情況下，於 37℃培養箱中作用 1 小時，以流式細胞儀分析 T 細胞和 B 細胞結合的比率。 (FL1: CFSE 標記的 T 細胞；FL2: PKH-26 標記的 B 細胞)
(B) 將(A)分析得到的數値加以換算成 T 細胞和 B 細胞結合的比率。
(有 OVA 存在下與 B 細胞結合的 T 細胞 / 所有 T 細胞)×100% - (無 OVA 存 在下與 B 細胞結合的 T 細胞 / 所有 T 細胞) ×100% = T 細胞和 B 細胞結合 的比率
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圖十六、在 NIH3T3 細胞中建立 paxillin 突變株
以帶有 paxillin 突變基因的反轉錄病毒感染 NIH3T3 細胞株，篩選表現黃色螢 光蛋白的細胞。收集表現黃色螢光蛋白的細胞之細胞萃取液，以 anti-paxillin 抗 體偵測外源表現的 paxillin。
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圖十七、由 wound-healing assay 分析表現各種 paxillin 突變株之 NIH3T3 細胞 之移動能力。
利用 wound-healing assay 分析表現 paxillin 磷酸化位置突變蛋白之 NIH3T3 細 胞的移動是否受到影響。相較於對照組細胞 YFP，不論是表現 S85A, S178A, S2A, Y2F 之細胞，其移動能力皆明顯降低。
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圖十八、Paxillin S178A/S85A 的基因轉殖小鼠胸腺及脾臟細胞數目與 同胎對照小鼠相近。
將小鼠的脾臟(圖 A)及胸腺(圖 B)細胞取出，懸浮於培養液。以細胞計數器計算 細胞數目。每個記號代表一隻小鼠。WT:同胎對照小鼠; Tg :Paxillin S178A/S85A 突變的基因轉殖小鼠。
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圖十九、、Paxillin S178A/S85A 的基因轉殖小鼠胸腺細胞與脾臟細胞族群的分 析。
以 PE-anti-CD4 和 FITC-anti-CD8 進行小鼠胸腺細胞及脾臟 T 細胞的染色。圖 為流式細胞儀分析的結果。每個樣本收 10000 個細胞，數字代表各族群細胞的 比例。基因轉殖小鼠之 CD4 和 CD8T 細胞之比例和同胎小鼠相比並無明顯差異。
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圖二十、Paxillin S178A/S85A 的基因轉殖小鼠胸腺細胞及脾臟 T 細胞在活化後 細胞增生減少。
(A) 以 anti-CD3 與 anti-CD28 共同活化刺激小鼠胸腺細胞(7×105個細胞/well)。
與同胎對照小鼠相比，基因轉殖小鼠的胸腺細胞在 TCR 刺激下，細胞增生減少。
(B) 以 anti-CD3 與 anti-CD28 共同活化刺激小鼠胸腺 T 細胞(4×105個細胞 /well)。與同胎對照小鼠相比，基因轉殖小鼠的脾臟 T 細胞在 TCR 刺激下，細胞 增生減少。
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圖二十一、Paxillin S178A/S85A 的基因轉殖小鼠之胸腺細胞及脾臟 T 細胞在活 化後細胞分泌的 IL-2 減少。
(A) 以 anti-CD3 與 anti-CD28 共同活化刺激小鼠胸腺細胞(7×105個細胞
/sample)。與同胎對照小鼠相比，基因轉殖小鼠的胸腺細胞在 TCR 刺激下，細 胞分泌的 IL-2 減少。
(B)以 anti-CD3 與 anti-CD28 共同活化刺激小鼠脾臟 T 細胞(4×105個細胞
(B)以 anti-CD3 與 anti-CD28 共同活化刺激小鼠脾臟 T 細胞(4×105個細胞