圖4-2-2、4-2-8、4-2-15、4-2-21、4-2-28、4-2-34，中軟骨細胞外 觀發現β-estradiol及testosterone濃度10-4 M的組別下軟骨細胞生長受 到嚴重影響，並在第一天即產生細胞死亡的現象，其中β-estradiol濃
度10-4 M的組別產生結晶的現象。而其餘組別細胞數量皆隨著天數增
加，且在第三天軟骨細胞在培養盤底部的生長空間皆達到飽和。其中 testosterone濃度10-5 M的組別在第三天時細胞外觀有呈現不規則紡錘 狀，細胞型態可能產生改變，圖4-2-35。
圖4-1-1 軟骨細胞顯微鏡觀察，control組第一天，100x。
圖4-1-2 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-4 M組第一天，100x。
圖4-1-3 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-5 M組第一天，100x。
圖4-1-4 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-6 M組第一天，100x。
圖4-1-5 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-7 M組第一天，100x。
圖4-1-6 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-8 M組第一天，100x。
圖4-1-7 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-9 M組第一天，100x。
圖4-1-8 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-4 M組第一天，100x。
圖4-1-9 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-5 M組第一天，100x。
圖4-1-10 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-6 M組第一天，100x。
圖4-1-11 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-7 M組第一天，100x。
圖4-1-12 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-8 M組第一天，100x。
圖4-1-13 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-9 M組第一天，100x。
圖4-1-14 軟骨細胞顯微鏡觀察，control組第二天，100x。
圖4-1-15 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-4 M組第二天，100x。
圖4-1-16 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-5 M組第二天，100x。
圖4-1-17 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-6 M組第二天，100x。
圖4-1-18 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-7 M組第二天，100x。
圖4-1-19 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-8 M組第二天，100x。
圖4-1-20 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-9 M組第二天，100x。
圖4-1-21 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-4 M組第二天，100x。
圖4-1-22 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-5 M組第二天，100x。
圖4-1-23 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-6 M組第二天，100x。
圖4-1-24 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-7 M組第二天，100x。
圖4-1-25 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-8 M組第二天，100x。
圖4-1-26 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-9 M組第二天，100x。
圖4-1-27 軟骨細胞顯微鏡觀察，control組第三天，100x。
圖4-1-28 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-4 M組第三天，100x。
圖4-1-29 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-5 M組第三天，100x。
圖4-1-30 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-6 M組第三天，100x。
圖4-1-31 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-7 M組第三天，100x。
圖4-1-32 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-8 M組第三天，100x。
圖4-1-33 軟骨細胞顯微鏡觀察，β-estradiol 10-9 M組第三天，100x。
圖4-1-34 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-4 M組第三天，100x。
圖4-1-35 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-5 M組第三天，100x。
圖4-1-36 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-6 M組第三天，100x。
圖4-1-37 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-7 M組第三天，100x。
圖4-1-38 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-8 M組第三天，100x。
圖4-1-39 軟骨細胞顯微鏡觀察，testosterone 10-9 M組第三天，100x。
4-2 軟骨細胞活性測試
完成上敘單一性荷爾蒙實驗後，由於人體內不論男性或是女性都會存 用β-estradiol 或 testosterone 有較好的細胞活性，同時也都比 control 組要好。
圖4-2-1 β-estradiol 濃度 10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M，
軟骨細胞MTT 測試結果。＊p<0.05 與 control 比。
圖4-2-2 testosterone 濃度 10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M，
軟骨細胞MTT 測試結果。＊p<0.05 與 control 比。
圖4-2-3 為 β-estradiol：testosterone 比例分別是 4：0、3：1、2：2、1：3、
0：4，兩種性荷爾蒙的濃度為 10-5 M。＊p<0.05 與 control 比。
＊
＊ ＊
圖4-2-4 為 β-estradiol：testosterone 比例分別是 4：0、3：1、2：2、1：3、
0：4，兩種性荷爾蒙的濃度為 10-6 M。＊p<0.05 與 control 比。
＊ ＊
＊
＊
圖4-2-5 為 β-estradiol：testosterone 比例分別是 4：0、3：1、2：2、1：3、
0：4，兩種性荷爾蒙的濃度為 10-7 M。＊p<0.05 與 control 比。
＊ ＊
＊
4-3 Proteoglycan 分泌量測定
軟骨細胞本身會分泌Proteoglycan 於細胞基質中，讓軟骨組織吸收大量的 水，而具有柔軟性，產生防震的功能。所以利用量測Proteoglycan 的濃度，
來了解軟骨細胞在含有性荷爾蒙的培養基中分泌Proteoglycan 的變化量，
以便觀察軟骨細胞是否具備原來的生理特性。
胞分泌GAGs 都有正面的影響，而兩者最佳濃度亦都落在 10-7M，顯示此 兩種性荷爾蒙在濃度10-7M 下，都能使軟骨細胞分泌 GAGs 的量增加，相 較於control 組或是其他濃度。
圖4-3-1 GAG 定量之標準曲線。
0 1 2 3 4 5
GAGs ug/100ul
0 0.2 0.4 0.6 0.8
abso rbance 65 0 nm
Y = 0.1407333333 * X + 0.002666666667 R-squared = 0.989797
圖4-3-2 β-estradiol 濃度 10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M，
圖4-3-3 testosterone 濃度 10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M，
4-4 基因表現
4-4-1 Agarose gel
經過 PCR 放大欲評估的基因後，為了證實放大基因無誤，必須以 Agarose 膠體電泳經 EtBr 染色來確認，如果染色後基因出現兩個以上
分子量表現，代表PCR 程序出錯，primer 沒有正確放大欲觀察之基
因。
圖 4-4-1 為第三天 GAPDH 基因 agarose gel 電泳圖，圖中全部組
別經EtBr 染色後的基因均呈現單一分子量，且無其他分子量基因，
代表PCR 放大程序無誤。
圖 4-4-2 為第三天 collagen type II 基因 agarose gel 電泳圖，圖中
全部組別經EtBr 染色後的基因均呈現單一分子量，且無其他分子量
基因，代表PCR 放大程序無誤。
圖4-4-1 GAPDH 基因 agarose gel 電泳圖，第三天。
圖4-4-2 collagen type II 基因 agarose gel 電泳圖，第三天。
4-4-2 PCR 基因表現定量 準化數值，表4-4-2(D)則是將表(C)標準化數值中各實驗組別與 control 組 比較，並以百分比的方式表示。
由表 4-4-2(D)中可以看到，第一天及第三天 collagen type II 基因的表現 上，β-estradiol 及 testosterone 各濃度組別均比 control 組要高，第一天在 β-estradiol 組別中發現濃度 10-5、10-6、10-9 M collagen type II 基因表現較高，
testosterone 組別中，而第一天 testosterone 的組別中濃度 10-7、10-8、10-9 M collagen type II 基因表現較高，第三天 β-estradiol 組別中以 10-5 M 的表現 要比其他濃度好，而testosterone 各組中以 10-7 M 表現最高。
表4-4-2(A) GAPDH 基因表現濃度，單位：ug/ml。
GAPDH
Day 0 117
Day 1
control 10-5 M 10-6 M 10-7 M 10-8 M 10-9 M
118
β-estradiol 85.8 119.6 102.6 77.4 28.2 testosterone 87.8 88.2 47.6 51.4 65.6 Day 3
control 10-5 M 10-6 M 10-7 M 10-8 M 10-9 M
95.2
β-estradiol 94.6 96.4 95.8 60.6 87.2 testosterone 91.2 102.4 62.6 67.6 65.6
表4-4-2(B) collagen type II 基因表現濃度，單位：ug/ml。
β-estradiol 93.4 130 102 75.6 30.4 testosterone 90.2 81.8 67.8 84 103.6 Day 3
control 10-5 M 10-6 M 10-7 M 10-8 M 10-9 M
91.2
β-estradiol 113.8 104.2 98.8 66.8 85.6 testosterone 89.6 110.2 96.6 89 84.8
表4-4-2(C) collagen type II 基因除上 GAPDH 基因之標準化數值。
β-estradiol 1.09 1.09 0.99 0.98 1.08 testosterone 1.03 0.93 1.42 1.63 1.57 Day 3
control 10-5 M 10-6 M 10-7 M 10-8 M 10-9 M
0.96
β-estradiol 1.20 1.08 1.03 1.10 0.98 testosterone 0.98 1.08 1.54 1.32 1.29
表4-4-2(D) 各濃度基因表現強度與 control 組比較以百分比表示。
β-estradiol +42% +42% +29% +27% +40%
testosterone +34% +20% +84% +112% +104%
Day 3
control 10-5 M 10-6 M 10-7 M 10-8 M 10-9 M
0.96
β-estradiol +25% +13% +7% +15% +2%
testosterone +2% +13% +60% +38% +34%
4-5 動物實驗 4-5-1(C)、4-5-1(D)為施打 testosterone 之冠狀切面及矢狀切面圖，圖
4-5-1(E)、4-5-1(F)為施打 β-estradiol 混合 testosterone 比例 1：1 之冠狀切面 及矢狀切面圖。由各實驗組別之核磁共振造影圖，並無法觀察出各組別影 像上軟骨位置的差異，推測可能與使用線圈非動物專用，造成兔子膝關節 軟骨影像的解析度不足，而無法觀察出各組兔子膝關節軟骨的差異。
圖4-5-1(A) 施打 β-estradiol 10-6 M 一周後之冠狀切面圖。
圖4-5-1(B) 施打 β-estradiol 10-6 M 一周後之矢狀切面圖。
圖4-5-1(C) 施打 testosterone 10-6 M 一周後之冠狀切面圖。
圖4-5-1(D) 施打 testosterone 10-6 M 一周後之矢狀切面圖。
圖4-5-1(E) 施打 β-estradiol 混合 testosterone 1：1 一周後之冠狀切面圖。
圖4-5-1(F) 施打 β-estradiol 混合 testosterone 1：1 一周後之矢狀切面圖。