構—mBSL-cAFL(175+245)、
5'-mBSL-D133A 5'-ACATCCATTTACAGCtccGCgGcgATGATTGTCATG
5'-mBSL-D133E 5'-ACATCCATTTACAGCtccGCgGaaATGATTGTCATG
5'-mBSL-I135D
引子 BSL-linker-cAFL 上粗體字為 EcoRV 切位，字母小寫為 AFL，Y230-T235，以 pET23a-mBSL-cAFL L(181+239)當模板，作 Quikchange PCR，可得到 pET23a-mBSL-cAFL(175+245) (圖 4 (a) )。
引子 BSL-linker-GGKPA-cAFL、5'-cAFL-F372A、5'-mBSL-D133A、
5'-mBSL-D133E 、5'-mBSL-I135D 、5'-mBSL-I135E 上粗體字為 SacII 切位，字母小寫為插入的 linker 胺基酸序列為 GGKPA 或突變點，以 pET23a-mBSL-cAFL(175+245)當模板，作 Quikchange PCR，可得到 突變株蛋白表達載體 (圖 5~10 (a) )。
PCR 反應總體積為 50 μL，內含 1 μL template DNA(約 10 ng)，
4 μL dNTP(2 mM)，1.5 μL 5’primer(10 mM)，1.5 μL 3’primer(10 mM)，
5 μL 10X PCR buffer，3 μL MgSO4(25 mM)，1 μL KOD Hot Start DNA polymerase(1 U/μL)，最後以去離子水補至 50 μL 於進行反應，PCR program 為：
No. of Cycles Reaction Temperature Time
1 Hot-start 94 ℃ 4 min
30 terminater、Ampicillin resistant 基因，以及 multiple cloning site。所 選殖的基因由 T7 RNA polymerase 啓動，利於大量表達重組蛋白。
2. 質體DNA的製備
將菌株接種到含有 3 mL LB medium （含抗生素，100 μg/mL 之 Ampcillcin）中，進行隔夜培養。以 13,000 rpm，1 分鐘離心，並收 集菌體，以 GeneMark 廠牌之 Plasmid Miniprep Purification Kit 操 作條件進行，取得質體 DNA。
四、質體轉型
1. 勝任細胞 (competent cell)的製備
首先挑取 E. coli 品系 BL21(DE3) 或 DH5α之單一菌落，接種
挑單一菌落，接種於 3mL LB medium，含 100 μg/mL
IPTG(isopropyl-D-thiogalactopyranoside)培養 2.5 小時以誘導蛋白質 大量表現。
2. BSL-cAFL 表達條件
培養於 37℃、225 rpm，並加入終濃度為 1.0 mM 的 IPTG 培養 4 小時以誘導蛋白質大量表現。
七、蛋白質的純化
1. 超音波破菌法 (sonication)與滲透壓休克純化法 (osmotic shock)
50 mL LB medium 經誘導培養後的菌液，以 7,000 rpm、4℃，
離心 10分鐘後，除去上清液，將菌體重新懸浮於 10 mL sonication lysis buffer ( 0.1M NaCl，50 mM Sodium phosphate pH 8.0 ) 中，以超 音波破菌法破菌 (震盪 20秒，休息 10秒，共震盪 5分鐘)，以
2. Histidine-tagged 蛋白質純化 2.1 親合性層析管柱製備
填充 1 mL His-tag resin GE Healthcare Ni Sepharose 6 Fast Flow) 於 Poly-Prep Chromatography Columns (Bio-rad)中，以 5 mL 無菌去 離子水注入管柱中清洗 resin，接著注入 5 mL Binding buffer (含
0.1M NaCl，50 mM Sodium phosphate pH 8.0)平衡管柱，完成 His-bind column製備。
2.2 可溶性Histidine-tagged蛋白質純化
將預先製備之蛋白質注入 His-bind column，收集流出液，並以 5 mL Wash buffer (含0.5M NaCl，20 mM Imidzaole，20 mM Sodium phosphate pH 8.0)，清洗管柱以去除雜蛋白，最後再以 5 mL Eoution buffer (含0.5M NaCl，500 mM Imidzaole，20 mM Sodium phosphate pH 8.0)，將目標蛋白質衝提。
2.3 包涵體Histidine-tagged 蛋白質純化
參考方法七-1，且將 sonication lysis buffer 更換為 IB wash buffer (20 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，1% Triton X-100，pH 7.5)，
使用超音波破菌後，以 7,000 rpm，於 4℃ 離心 10分鐘，去除可溶 性蛋白質，留下沉澱物，上述步驟重覆三次後，最後將沉澱物回溶 於 Solubilization buffer (50 mM CAPS，0.3% N-lauroylsarcosine，pH 11.0) ，於冰上靜置 15分鐘後，以 7,000 rpm，於 4℃ 離心 10分 鐘，取上清液進行透析式摺疊 (Dialysis refolding)。
八、蛋白質的透析 (Dialysis)、透析式摺疊 (Dialysis
refolding)
以含有 20 mM Sodium phosphate pH 8.0為透析溶液，於 4℃ 下
利用 p-nitrophenol 呈色法測定， p-nitrophenyl esters 被脂肪酶水 解之後得到黃色 p-nitrophenol 產物，在波長 405 nm 有最大吸光強 度。 Good's buffer (CHES, CAPS, NaOAc．3H2O, Bis-Tris propane) 配
製成 50 mM, pH 7.0 之緩衝溶液，含 2.5% Triton X-100。以 20 mM p-nitrophenyl palmitate 為受質，溶於 100% iso-Propanol 中。每次反 應取 900 μL Good’s buffer 於欲測定之反應溫度下平衡 2 分鐘，加入 100 μL 受質，混合均勻後取 100 μL 的受質溶液分裝置 96 孔微量滴 定盤與10 μL 酵素溶液反應，本實驗以 Multiskan™ FC Microplate Photometer (Thermo scinentific)內建之 kinetic measurements 的計算方 式得到最大速率，除以 p-nitrophenol 之莫耳消光係數 (11000
OD/M/cm)，乘上反應總體積，便可推算出酵素活性單位 (Unit) 之 後，除以加入反應之總酵素量，即可得到比活性。
酵素活性單位 (1 unit) 定義為：在上述條件下，每分鐘水解 1 μmole p-nitrophenyl ester 成為 p-nitrophenol 及 fatty acid 所需的酵 素量。
3. 受質專一性分析
分別配製 20 mM 之不同鏈長之 p-nitrophenyl esters, 分別為：
p-nitrophenyl butyrate (C4), p-nitrophenyl palmitate (C8)和
p-nitrophenyl palmitate (C16)，以 100% iso-Propanol 為溶劑。每次反 應取 900 μL Good’s buffer 於欲測定之反應溫度下平衡 2 分鐘，加入 100 μL 受質，混合均勻後取 100 μL 的受質溶液分裝置 96 孔微量滴 定盤與10 μL 酵素溶液反應。分析條件同 十-1 之測定方法。
十一、電腦模擬預測 mBSL-cAFL 立體結構
為了探討 mBSL-cAFL 與受質作用時結構上之關係及蛋白質的穩 定性，本研究委託中央研究院蛋白質結構核心設施，將原始 BSL 與 cAFL，作能量最適化的結合後，得到 3-D 結構模擬模型。
利用電腦軟體 (Pymol) 及網路伺服器 (Swiss-Model) ，以 AFL 已知結晶結構作為模板，模擬出 mBSL-cAFL(175+245) 之 3-D 結構 模擬模型。
參、結果
一、構築 BSL-cAFL fusion 於 E. coli 內表達並進行純化 1. 質體構築
pBSL-cAFL(212+239) 和 mBSL-cAFL(181+239) 之重組質體建 構(圖 2 (a) 和圖 3 (a))，以限制酶 NdeI 和 SalI 圖 2 (b) 和圖 3 (b))
secretion signal peptide 無法被 E. coli 辨認。 別用 N-lauroylsarcosion 和 Urea，不同的變性劑，溶解包涵體蛋白質 後透稀折疊，結果顯示，分子較大的 N-lauroylsarcosion，有利於蛋白 質折疊，其測得活性較大(圖 25 (b))。
二、mBSL-cAFL fusion 活性分析
融合蛋白 mBSL-cAFL(181+239)之活性與受質專一性分析，
其 BSL 末端 Loop 結構，G176-N181 與 AFL 的 N 端與 C 端之間的連 接 Y230-T235 並無法疊合。因此構築新的重組融合蛋白
mBSL-cAFL(175+245)，其延長 C 端 AFL，取代 BSL 末端 Loop 結構 G176-N181。
網路伺服器 (Swiss-Model) 作 mBSL-cAFL(175+245)，三級結構 的模擬，於活性中心上，觀察到催化三元體中的 Asp134 與 His157 距離較遠，因此構築新的重組融合蛋白 mBSL-cAFL(175
+245)/D133A，來確定此 fusion protein 是否為 Catalytic triad (圖 40)。
同時也構築新的重組融合蛋白 mBSL-cAFL(175 +245)/D133E，以便推
測此三級結構模擬之活性中心相對位置是否準確 (圖 41)。
另外在催化三元體中的 His157 附近的 I135，欲將其突變為 Asp136 或 Glu136，來代替距離較遠 Asp134，因此構築新的重組融 合蛋白 mBSL-cAFL(175 +245)/136D (圖 42) 和 mBSL-cAFL(175 +245)/136E (圖 43)。
2. 質體構築
pET23a-mBSL 、pET23a-mBSL-cAFL(181 +239) 、 pET23a-mBSL-cAFL(175 +245) 、
pET23a-mBSL-cAFL(175+linker+245) 、 pET23a-mBSL-cAFL(175+245)/F372A 、 pET23a-mBSL-cAFL(175+245)/D133A 、 pET23a-mBSL-cAFL(175+245)/D133E 、 pET23a-mBSL-cAFL(175+245)/I135D 、
pET23a-mBSL-cAFL(175+245)/I135E 之重組質體建構 (圖 1 、 3~10 (a))以 DNA 電泳、定序確認 (圖 1 、 3~10 (b)、(c))。
3. 蛋白質表達
將上述構築質體，轉型至 E. coli BL21(DE3) 細胞內，做為蛋 白表達 (圖 11 、 13~21 (a)) 誘導條件參照方法六-1 和 六-2。將上
述構築質體誘導表達後，粗萃蛋白質進行活性分析 (圖 11 、 13 ~21 (a) )，其中 mBSL-cAFL(175+245)/D133A 和
mBSL-cAFL(175+245)/I135E 之粗萃蛋白質尚未測得脂肪酶活性。
mBSL-cAFL(175+245) 和 mBSL-cAFL(175+linker+245)進行活性分
析，結果顯示，在 50℃下短碳鏈脂肪酸受質的水解活性
確認融合蛋白活性中心以 mBSL-cAFL(175+245)/D133A 、 mBSL-cAFL(175+245)/D133E 、 mBSL-cAFL(175+245)/I135D 和 mBSL-cAFL(175+245)/I135E，結果顯示，突變株並無法提升對中、
長碳鏈脂肪酸受質的水解活性，mBSL-cAFL(175+245)/D133A 在 50
℃下短碳鏈脂肪酸受質的水解活性較 mBSL 相似，同上述條件下 mBSL-cAFL(175+245)/I135D 較 mBSL 則仍保有 57% 的水解活性 (圖 36) (表 4)。
肆、討論
一、構築 BSL-cAFL fusion 於 E. coli 內表達並進行純化
保留 Bacillus subtilis 的 secretion signal peptide 的目的在於，希 望藉由 Bacillus subtilis 的 secretion signal peptide，將目標蛋白表達於 周質間(periplasmic space)，因為周質間的雜蛋白少，以利於之後進行 純化，但是缺點則是表達量少，若去除 Bacillus subtilis 的 secretion signal peptide 成 mBSL 則目標蛋白將表達於胞內，優點是表達量較 多，缺點是雜蛋白多，不便於之後進行純化。結果顯示， E. coli BL21(DE3) 無法辨認 Bacillus subtilis 的 secretion signal peptide，導致大部份的目標蛋白，仍表達於胞內。
二、mBSL-cAFL fusion 活性分析
mBSL-cAFL 可能因為構型的關係，導致末端的 histidine tag，無 法被 Ni column 吸附，因此需藉由其它管柱層析來純化可溶性蛋白 質，結果顯示，可利用疏水層析管柱（HIC）將目標蛋白純化；而 mBSL 則可利用 Ni column 順利純化。
另外將 mBSL-cAFL 包涵體蛋白質，清洗後，分別溶於不同的 detergent，包括 Urea 或 N-lauroylsarcosion 後，作透稀折疊。結果顯 示，利用 N-lauroylsarcosion 溶解後，作透稀折疊活性較高於使用疏
水層析管柱（HIC）純化粗萃蛋白中的可溶蛋白。因 N-lauroylsarcosion
而 mBSL-cAFL(175+245) 在高溫下對於短、中、長碳鏈長脂肪酸 受質活性，與 mBSL 無顯著差距。模擬結構觀察到，C 端 AFL 覆蓋 於 mBSL 的表面疏水凹槽上的活性中心，因此設計一段 Linker 於 C
端 AFL，希望讓兩端之間能夠稍微分開，以利於脂肪酸受質進入 心設施，模擬 mBSL-cAFL(175+245) 的模型中，由立體結構發現，
觀察到 C 端 AFL 覆蓋於 mBSL 的表面疏水凹槽上的活性中心，而位 株 mBSL-cAFL(175+245)/D133A 和 mBSL-cAFL(175+245)/D133E，顯
示融合酵素在高溫下可能是以具有催化二元體的形式來進行催化作 用。另外將 H156 附近的 I135，突變為 D135 或 E135，其中
mBSL-cAFL(175+245)/D133A 和 mBSL-cAFL(175+245)/I135E 其受 質特異性與 mBSL 催化活性比例不同，可得知在高溫下構型與常溫下 構型不同。活性中心突變株雖然仍具有活性，但活性降低，顯示融合 蛋白，此模擬結構方法可搭配蛋白模擬程式，以利於從結構上來解釋 蛋白質性質的變化。
蛋白模擬預測與實際測得活性無法吻合，因此未來可嘗試在 mBSL-cAFL(181+239)加入外插的 linker 於 mBSL 與 cAFL 之間，期 待在高溫下二者以最佳的結合方式形成穩定的結構，在高溫下提升催
伍、參考文獻
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(a) (b)
圖 1. pET23a-mBSL 重組質體構築 (a
) pET23a-mBSL 重組質體圖譜重組質體上 5 端限制酶切位: NdeI、3 端限制酶切位: SalI 藍色: mBSL 為 546 bp
(b) 構築 pET23a-mBSL 重組質體以限制酶 NdeI 和 SalI 確認之圖 譜分析
Lane 1 : pET-23a-mBSL 質體
Lane 2 : pET-23a-mBSL 質體經 NdeI 和 SalI 酵素雙切割。
Lane M : 1kb DNA ladder (Bioman) 作為片段大小標記。
上述於 1% 洋菜膠 DNA 電泳照片。
(a) (b)
圖 2. pET23a-pBSL-cAFL(212+239) 重組質體構築
(a) pET23a-pBSL-cAFL(212+239) 圖譜重組質體上 5 端限制酶切位: NdeI、3 端限制酶切位: SalI 紅色: pBSL 為 636 bp
藍色: cAFL 為 717 bp
(b) 構築 pET23a-pBSL-cAFL(212+239) 重組質體以限制酶 NdeI 和 SalI 確認之圖譜分析
Lane 1 : pET23a-pBSL-cAFL(212+239) 質體經 NdeI 和 SalI 酵素雙 切割。
Lane M : 1kb DNA ladder (Bioman) 作為片段大小標記。
上述於 1% 洋菜膠 DNA 電泳照片。
(a) (b)
圖 3. pET23a-mBSL-cAFL(181+239) 重組質體構築
(a) pET23a-mBSL-cAFL(181+239) 圖譜重組質體上 5 端限制酶切位: NdeI、3 端限制酶切位: SalI 紅色: mBSL 為 543 bp
藍色: cAFL 為 717 bp
(b) 構築 pET23-mBSL-cAFL(181+239) 重組質體以限制酶 NdeI 和 SalI 確認之圖譜分析
Lane 1 : pET23-mBSL-cAFL(181+239) 質體
Lane 2 : pET23-mBSL-cAFL(181+239) 質體經 NdeI 和 SalI 酵素雙 切割。
Lane M : 1kb DNA ladder (Bioman) 作為片段大小標記。
上述於 1% 洋菜膠 DNA 電泳照片。
(a) (b)
(c)
圖 4. pET23a-mBSL-cAFL(175+245) 重組質體構築
(a) pET23a-mBSL-cAFL(175+245) 圖譜重組質體上 5 端限制酶切位: NdeI、3 端限制酶切位: SalI、突變點限 制酶切位：EcoRV
紅色: mBSL 為 525 bp 藍色: cAFL 為 735 bp
(b) 構築 pET23a-mBSL-cAFL(175+245) 重組質體以限制酶 EcoRV 確認之圖譜分析
Lane 1 : pET23a-mBSL-cAFL(181+239) 質體經 EcoRV 酵素切割。
Lane 2 : pET-23a-mBSL-cAFL(175+245) 質體經 EcoRV 酵素切割。
Lane M : 1kb DNA ladder (Bioman) 作為片段大小標記。
上述於 1% 洋菜膠 DNA 電泳照片。
(c) 構築 pET23a-mBSL-cAFL(175+245) 重組質體定序分析
(a) (b)
(c)
圖 5. pET23a-mBSL-cAFL(175+linker+245) 重組質體構築
(a) pET23a-mBSL-cAFL(175+linker+245) 圖譜重組質體上 5 端限制酶切位: NdeI、3 端限制酶切位: SalI、突變點限 制酶切位：SacII
紅色: mBSL 為 525 bp 藍色: cAFL 為 735 bp
黑色：linker 為 15 bp，胺基酸組成依序為：GGKPA
(b) 構築 pET23a-mBSL-cAFL(175+linker+245) 重組質體以限制酶 SacII 確認之圖譜分析
Lane 1 : pET23a-mBSL-cAFL(175+245) 質體經 SacII 酵素切割。
Lane 2 : pET-23a-mBSL-cAFL(175-24linker-245) 質體經 SacII 酵素 切割。
Lane M : 1kb DNA ladder (Bioman) 作為片段大小標記。
上述於 1% 洋菜膠 DNA 電泳照片。
(c) 構築 pET23a-mBSL-cAFL(175+linker+245) 重組質體定序分析