PL：persimmon leaf；Sp：Spring；Su：Summer；Fa：Fall
2.石柿柿葉茶製備之原料：
採摘自 2008 年 4 月 23 日新竹縣北埔鄉栽植之石柿柿葉，將之洗 淨晾乾，秤取所需重量並分別採取不同乾燥溫度處理、殺菁處理及揉 捻處理等方式依序製備。
(二)儀器：
1. 真空冷凍乾燥機：Freeze dryer，ILSHIN，FD5518 2. 熱風乾燥機：Air dryer，CHERNG-HUEI，DO-60B
3. 旋轉真空濃縮機：Rotary vacuum evaporator，EYELA ，N-1000 series
4. 桌上型離心機：Table top centrifuge，TAIWAN，DSC-1512 5. 樣品切割機：Sample miller，CEMOTEC，Cenotec-1090 6. 分光光度計：Spectrophotometer，HITACHI，U-2001
7. 色差計：Chroma meter，CHENG-YANG，Hunterlab-Colorflex 8. pH 儀：pH meter，HANNA ，pH211
(三)化學藥品：
1.標準品：
Butyl-hydroxylanisole (BHA) (Assay), Quercetin dehydrate 98% (Assay),
Gallic acid 98% (Assay), L-Ascorbic acid (Assay)購自 Fluka 公司 Ethytlenediaminetetraacetic acid Mg-Na salt (EDTA) (Assay) 購 自 Haverhill 公司。
Glucose (試藥級) 購自日本試藥工業株式會社。
2.試劑：
2,6-Dichloroindophenol (Assay),
3-(2-Pyridyl)-5,6-di(p-sulfophenyl)-1,2,4-triazine, disodium salt (Assay), a,a-Diphenyl-β-picrylhydrazyl free radical (DPPH) (Assay), Iron(III) Chloride hexahydrate 98% (Assay), Linoleic acid 99%, Trichloroacetic acid (Assay) 購自 Sigma 公司。
Boric acid(試藥級), Copper(Π)sulfate(試藥壹級) Ethanol 75％, Ethyl ether, Formalin (HCHO) 37% (試藥級), Hydrogen chloride (HCl) (試藥 級), Kaolin(試藥壹級), Potassium Permanganate (KMnO4) (試藥級), Sodium chloride (NaCl) (試藥壹級), Sodium hydroxide (試藥特級) 購自 日本試藥工業株式會社。
Potassium sulfate(試藥壹級) 購自島久藥品株式會社。
Sulfuric acid(和光一級) 購自和光純藥工業株式會社。
Indigo carmine(試藥級) 購自 Colnbrook-Bucks 公司。
Ammonium Thiocyanate (Assay), Bromocresol green ( 試 藥 級 ), Metaphosphoric acid(試藥級), Methyl red(試藥級), Potassium acetate (試
藥級)購自 Riedel-deHaën 公司。
Methanol 95% (ACS) 購自景明化工股份有限公司。
Folin-Ciocalteu's phenol agent (Assay), Iron(II) Chloride tetrahydrate (Assay), Potassium hexacyanoferrate(III) (Assay), Sodium dihydrogen phosphate dihydratre (NaH2PO4．2H2O) (Assay), Sodium hydrogen phosphate dihydratre (Na2HPO4．2H2O) (Assay), Tween20 (Assay)購自 Merck公司。
Aluminiumnitrat-9-hydrat (試藥級), Anthrone (試藥級), Sodium carbonate anhydrous AR (Na2CO3) (試藥級) 購自Ferak公司。
二、實驗方法
(一)石柿柿葉一般組成分析 1.前處理：
將石柿柿葉洗淨晾乾，並取所需之重量進行一般組成份之分析。
2.石柿柿葉一般組成份分析：
(1)水分含量測定：
參考AOAC(1984)所列之方法進行測定。秤 1g石柿柿葉(W1)，洗淨 鋪平在已恆重的盤子(W2)上，放於 105 oC烘箱中烘至恆重(W3)，水分 含量計算，由重量損失量除以原樣品重乘以100%，公式如下：
(2)粗蛋白含量測定：
參考AOAC(1984) 所列之方法進行測定。秤 1g石柿柿葉(W3)置入分解 管中，加入催化劑(K2SO4：CuSO4=1：5；w/w)，並沿著管壁加入 20mL 濃硫酸使之分解，在蒸餾方面，將分解管裝入凱氏氮蒸餾裝置，再加入 30% NaOH直到溶液成黑褐色，蒸餾約 10 分鐘，再以 75mL 4%硼酸與混 合指示劑(0.2％甲基紅酒精溶液：0.2％溴甲酚綠酒精溶液＝1：5)的三角 錐型瓶作為接收部分，而滴定部分以 0.1N鹽酸溶液滴定至桃紅色，記錄 消耗 0.1N鹽酸溶液之毫升數(V1)和空白組消耗 0.1N鹽酸溶液毫升數 (V2)，其粗蛋白含量計算公式如下：
粗蛋白含量(%)＝[(V1－V2)×F×0.014×6.25/W3 ×(100％-水份含量
％)]×100 (以乾基表示) 其中0.1N (1mL) HClÆ 1mol N＝0.0014 g N
F：0.1N 鹽酸標準溶液之力價 (F＝實際濃度/理論濃度)
(3)粗脂肪含量測定：
參考AOAC(1984) 所列之方法進行測定。將圓底燒瓶放在烘箱中，
並以105 oC烘至恆重，並紀錄該重量(W1)，秤取石柿柿葉 1g並紀錄重 量(W2)，將石柿柿葉放入圓筒濾紙中，再用脫脂棉塞住洞口，再把圓 筒濾紙放入脂肪接收瓶中，並在抽氣櫃內加入200mL的乙醚，接上迴
流管，開啟冷凝水與恆溫水浴槽，使溫度介於50-60 oC，萃取完後取 下圓筒濾紙與脂肪接受瓶。將圓底燒瓶放入烘箱烘至恆重並記錄重量 為W3，其粗脂肪計算公式如下：
粗脂肪(%)＝[(W3－W1)/W2 ×(100％-水份含量％)]×100 (以乾基表示)
(4)粗灰份含量測定
參考AOAC(1984) 所列之方法進行測定。將坩堝用 10％鹽酸溶液 煮2 小時候並清洗乾淨，並將烘箱設定 105 oC烘至恆重並紀錄重量為 W1，秤取 1g於坩堝中並紀錄重量為W2，再用 550oC灰化，直至樣本 灰白色粉末，去出坩堝移至乾燥皿冷卻紀錄重量為W3，計算粗灰份含 量公式如下：
粗灰份(%)＝[(W3－W1)/(W2－W1)×(100％-水份含量％)]×100 (以乾基表示)
(5)碳水化合物
碳水化合物(%)＝100－(粗蛋白含量(%)＋粗脂肪(%)＋粗灰份(%)) (以乾基表示)
(二)石柿柿葉萃取物之相關活性成分分析 1.樣品前處理與製備：
本研究將採摘之石柿柿葉(採摘時間為 2007 年 4 月至 10 月)，經 洗淨晾乾後，並以冷凍乾燥方式，進行製備分析樣本，秤取所需之樣 本放入三角錐形瓶中(紀錄秤取之石柿柿葉重)，並加入 100mL甲醇，
配合搖瓶震盪方式，進行萃取(萃取過程需避光)三小時，並將萃取液 過濾，以真空減壓濃縮機，進行萃取液濃縮，並算出固形物量，並將 每次濃縮後的固形物，再以甲醇作為溶劑，配製固定濃度(mg/L)，並 存放在-18 oC冷凍庫中待置存放分析(存放過程採取避光)。
甲醇萃取率＝(固形物重/樣品重)×100 (％)
2.抗氧化分析：
(1)總酚含量測定
取0.25mL之石柿柿葉甲醇萃取液，加入0.75mL去離子水和0.5mL Folin-Ciocalteu’s試劑及2.5%Na2CO3溶液，震盪混勻後，放置20分鐘，
以760 nm之下吸光值。以沒食子酸(Gallic acid)為標準品，並製作標準 曲線，來換算石柿柿葉所含之總酚量。(Zainol et al., 2003；Meda et al., 2005；Tepe et al., 2007)
(2)類黃酮含量測定
取石柿柿葉甲醇萃取液 0.5mL，加入 1.5mL 之去離子水、0.1mL 之10%硝酸鋁及 0.1mL 之 1M 醋酸鉀，最後再加入 2.8mL 去離子水，
混合於室溫下靜置40 分鐘，以 415 nm 下之吸光值，並槲皮酮(Quercetin) 製作標準曲線，並換算出石柿柿葉類黃酮之含量。(Meda et al., 2005；
Chang et al., 2006)
(3)抗壞血酸含量測定
將0.5g石柿柿葉，以50mL 濃度為 1% 之metaphosphoric acid 萃取 1 小 時 ， 過 濾 後 ， 取 1mL 濾 液 加 入 9mL 濃 度 為 0.05 mM 之 2,6-dichloroindophenol（DCIP），反應15 秒後並以515 nm照射，測定 吸光值，再與抗壞血酸標準曲線（0、10、20、30、40、50 μg/mL）比 照定量，進而換算石柿柿葉抗壞血酸含量(Klein et al.,1982；Chang et al., 2006)。
(三)石柿柿葉萃取物之抗氧化分析
(1)清除 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH)自由基能力測定
取 1mL 不同濃度之石柿柿葉甲醇萃取液，並加入現配製 0.2mM 1mL DPPH 均勻混合，反應 30 分鐘後於 517 nm 照射，測定吸光值，
公式為[(空白組吸光值－實驗組吸光值)/空白組吸光值]×100% (Amro et al., 2002；Tepe et al., 2007)
(2)螯合亞鐵離子能力測定
取 1mL不同濃度之石柿柿葉甲醇萃取液及加入 0.1mL 2mM FeCl2.4H2O溶液混合均勻，反應 30 秒後。再加入 0.2mL 5mM Ferrozine 反應10 分鐘後，再用 562 nm測定吸光值，採用EDTA作標準品，並以 甲醇做空白組，而螯合能力的計算公式為螯合能力(%)＝[(空白組吸光 值－實驗組吸光值)/ 空白組吸光值] ×100% (Yang et al., 2006)
(3)還原力測定
本實驗採用Ascorbic acid及BHA作標準品，並取 1mL不同濃度石 柿柿葉甲醇萃取液，加入1mL 0.2M磷酸緩衝溶液(pH6.6)、1mL 1% 赤 血鹽，並在50 oC水浴 20 分鐘後迅速冷卻，再加入 1mL 10%三氯醋酸 (Trichloroacetic acid)，之後再用 3000rpm離心 10 分鐘，並取上層液 1mL，加入 0.2mL 0.1%ferric chloride(FeCl3.6H2O)，反應 10 分鐘後以 700 nm測定吸光值，若吸光值越高代表還原力越強。(Duh et al.,1997；
Amro et al.,2002)
(4)抑制亞麻油酸自氧化能力
本實驗採用Trolox作標準品，並以甲醇做空白組，之後取 0.5mL 石柿柿葉甲醇萃取液，在加入 2.5mL亞麻油酸乳化液(以Tween20 做為 乳化劑)、2mL (pH 7.0) 0.2 M 磷酸緩衝溶液，混勻後置於 37oC烘箱中 反應並採取每隔12 小時進行分析(進行 72 小時反應)，在每次 12 小時 檢測時，取出0.1mL混和液，再加入 4.7mL 75%乙醇、0.1mL NH4SCN、
0.1mL 0.02M(FeCl2.4H2O)，反應 3 分鐘後，並以 500 nm照射，測定吸 光值，若吸光值越低，抗氧化能力越強 (Siddhuraju, 2007；Ardestani et al., 2007)
(四)不同製程之石柿柿葉茶之製備 不同製程之石柿柿葉茶製備分述如下：
本研究依據一般製茶流程加以修改以製備石柿柿葉茶，其製程探討 分三種不同製程設計(包含不同乾燥溫度處理、殺菁處理及揉捻處理) 進行，如附圖四所示，其詳細說明如下：
(1)不同乾燥溫度處理：
選用 50 、70 、90 oC三種不同乾燥溫度(不經殺菁和揉捻處理)進 行製備石柿柿葉茶，秤取所需之石柿柿葉並記錄重量、洗淨晾乾，將 石柿柿葉以低溫熱風乾燥(30 oC；3 小時)進行萎凋，之後取出石柿柿 葉，分別以50 oC (3 小時) 、70 oC (2 小時) 、90 oC (1 小時)三種乾燥 溫度處理烘製出石柿柿葉茶，並分別以PTt50、PT70 及PTt90 表示之。
(2)殺菁處理：
從不同乾燥溫度處理找出最佳乾燥溫度並再配合殺菁處理，秤取 所需之柿葉並記錄重量、洗淨晾乾，並以蒸氣殺菁方式進行殺菁(100
oC；2min)，殺菁完成之後，取出並快速浸泡冷水使之冷卻，再將石柿
柿葉瀝乾，之後再以50oC熱風乾燥，進行最後乾燥處理烘製出石柿柿 葉茶，並以PTS表示之。
(3)揉捻處理：
從不同乾燥溫度處理找出最佳乾燥溫度並配合揉捻處理，秤取所 需之柿葉並記錄重量、洗淨晾乾，並以揉捻方式進行 1 小時揉捻，之 後取出柿葉，再以50oC熱風乾燥，進行最後乾燥處理烘製出石柿柿葉 茶。並以PTR表示之。
註：PT：persimmon leaf tea；t：temperature；R：rolling；S：steaming。
附圖四、石柿柿葉茶製備流程
(五)石柿柿葉茶湯分析 茶湯製備：
取 3g石柿茶葉，以 500mL 95 oC熱水浸泡 15 分鐘、將茶湯進行抗氧 化分析、理化性質測定及感官品評。
1.不同製程石柿柿葉茶湯之抗氧化分析：
將不同乾燥溫度處理(包含 PTt50 、PTt70 、PTt90)、殺菁處理(PTS) 及揉捻處理(PTR)之石柿柿葉茶分別進行總酚含量、類黃酮含量、抗壞 血酸含量及抑制亞麻油酸自氧化能力分析，並找出石柿柿葉茶最適抗 氧化性之加工製程方式。
2.理化性質測定：
(1)可溶性醣含量測定：
將各製程之茶湯分別稀釋 10 倍，取 0.2 mL茶湯放入試管中並加入 1.8 mL蒸餾水及 4 mL anthrone試劑，並在冰浴中混合均勻。之後置入 100 oC水浴中 7.5 分鐘，取出迅速冷卻，再以波長 630nm測其吸光值。
另外採用葡萄糖(glucose)作為標準品，並製出標準曲線，換算出不同 製程之石柿柿葉茶之可溶性醣含量。(陳，1994)
(2)單寧含量測定：
取 1 mL之不同製程之石柿柿葉茶湯，在加入 40 mL蒸餾水，並煮 沸30 分鐘後(需防止煮乾)，置於 50mL量瓶內，加入蒸餾水至 50 mL。
之後取此試液1 mL(混濁時必須過濾)，加入 2.5mL indigo carmine溶液 和75 mL蒸餾水，並以KMnO4標準液進行滴定，當液體變為明黃色或 液體的邊緣稍變為淡粉紅色即為滴定終點，並紀錄滴定體積為a mL。
然後將10 mL試液加入三角錐形瓶內，在加入 5 mL gelatin溶液、10 mL 食鹽酸性溶液及1g高嶺土。震盪 5 分鐘後將之過濾，取濾液 2.5 mL，
再加入2.5 mLindigo carmine溶液和 75 mL蒸餾水，並以KMnO4標準液 進行滴定，並紀錄滴定體積為b mL (賴，1993)
註：供試液中1 mL 中單寧量為：4.16mg × (a－b)F
0.1N KMnO4 1mL 是相當於 4.16mg的gallotannic acid F：0.1N KMnO4標準溶液之力價(F＝實際濃度/理論濃度)
(3)游離胺基酸含量測定
將 pH 儀進行校正，進行空白試驗，秤取 25g 樣品及 10 mL 蒸餾水，
之後以0.01N NaOH 滴定至 pH8.1 為止及紀錄滴定體積(b mL)，之後 將37 %甲醛溶液(取 30 mL)先以 0.1N NaOH 調整 pH 值至 8，再改以 0.01N NaOH 滴定至 pH 8.1，再 25g 樣品(先以 0.1N NaOH)及 10 mL
甲醛溶液，混合均勻3 分鐘，最後再用 0.01N NaOH 滴定至 pH8.1 及 紀錄滴定體積(a mL)(賴，1993)
註：甲醛態氮(%)＝(a－b)mL × 0.01N × F × 14 × 100/樣品重(g) F：0.01N NaOH 溶液之力價(F＝實際濃度/理論濃度)
(4)茶湯 pH 值測定：
將不同製程石柿柿葉茶湯以濾紙進行過濾，取適量之茶湯，並使用 已校正之pH meter(HANNA, pH211)進行測定石柿柿葉茶湯酸鹼值，且 將不同製程石柿柿葉茶湯分別重複三次測定，並以統計分析比較其差 異。
(5)茶湯水色測定：
不同製程之石柿柿葉茶湯水色變化：使用色差儀(Hunter Lab, Color Flex)測定不同製程之石柿柿葉茶湯之 L、a、b 值。標準白板 L=92.93，
a=-1.26，b=1.17。L 代表亮度由黑(0)~白(100)，a 代表紅(＋)~綠(－)，
b 代表黃(＋)~藍(－)，總色差變化量(total color change； E)△ 代表總色 差變化量。不同製程石柿柿葉茶湯分別三重覆，並以統計分析比較其 差異。(范，2006)
E
△ ＝( L)△ 2＋( a)△ 2＋( b)△ 2
3.茶湯感官品評：
將不同製程之石柿柿葉茶與市售產品，請由 40 位品評人員進行感官 品評。其品評項目包括顏色(color)、口感(taste) 、香味(aroma)及喜好 度等。品評過程中，品評人員依喜歡與否之程度，採取五分制進行評
將不同製程之石柿柿葉茶與市售產品，請由 40 位品評人員進行感官 品評。其品評項目包括顏色(color)、口感(taste) 、香味(aroma)及喜好 度等。品評過程中，品評人員依喜歡與否之程度，採取五分制進行評