其實很多細胞皆會表現 12-LOX，包含了胰臟細胞、血管平滑肌細胞 (VSMCs) 和 血 小 板 等 。 而 且 在 癌 症 細 胞 中 也 同 樣 發 現 會 表 現 出 12-LOX，包括了人類直腸腫瘤細胞、人類肺腫瘤細胞和胃腫瘤細胞 (Jiang et al., 2003; Ohd et al., 2003)。在先前的電子順磁共振儀 (ESR) 研究結果發現，baicalein 在血小板懸浮液 (platelet suspension)中可以 產生 four-line 的 hydroxyl radical 訊號且認為必須透過 12-LOX 而來 (Chou et al., 2007)。而最近的研究也發現 baicalein 可以在 B16F10 小 鼠黑色素瘤細胞透過12-LOX 產生 hydroxyl radical，進一步抑制黑色 素瘤細胞的生長和導致細胞凋亡(Chou et al., 2009)。但是導致細胞凋 亡的主要原因是因為 baicalein 抑制了 12-LOX，還是因為產生了 ROS，仍尚未被確切的探討到，所以我們想知道 baicalein 導致小鼠黑 色素瘤細胞凋亡的主要原因為何。
初步的結果發現在50 μΜ的 baicalein 作用下，細胞就會產生一些生長 變異的情況，像是細胞變的膨脹，部分細胞會破碎，細胞數量也會明
顯減少，這些都是細胞死亡的證據。在 MTT 實驗中也得到相同的結
果，細胞的存活率的確會下降(Fig. 2)。接著我們使用 ROS 清除劑，
來探討 baicalein 導致的小鼠黑色素瘤細胞死亡是否會與 ROS 有關，
結果發現，ROS 的清除劑雖然對於細胞的生長變異影響不大(Fig. 2 and Fig. 3)，但是可以有意義的恢復 baicalein 導致的細胞存活率下降 (Fig. 4)。所以我們推論 baicalein 誘導的細胞死亡，與 baicalein 誘導
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ROS 的產生有明顯的關係。而之前也早有研究證實，ROS 的產生會 導致細胞的死亡以及細胞壞死(Lockshin and Zakeri et al., 2002)。
另外有研究提到，baicalein 也會誘導 B16F10 小鼠黑色素瘤細胞的 active caspase-3 蛋白表現增加，最終造成細胞凋亡(賴彥安碩士論文., 2009)。而既然我們發現 ROS 清除劑可以有效地改善 baicalein 造成的 細胞死亡；接者下一步則是研究 ROS 清除劑，對於 baicalein 誘導的
細胞凋亡是否也有同樣的抑制效果，結果卻發現 ROS 清除劑對於
baicalein 所誘導的 active caspase-3 表現無明顯改變(Fig. 5)；所以推論 在 baicalein 作用 B16F10 細胞的實驗中，ROS 可以誘導細胞產生死 亡，但是此細胞死亡與細胞凋亡的關係並不大，這種不屬於細胞凋亡 的細胞死亡，極有可能是細胞壞死，ROS 造成的細胞壞死在之前的 研究中也被證實過(Finkel., 2001)。
確定 baicalein 導致地 B16F10 小鼠黑色素瘤細胞凋亡與 ROS 無明顯 關係後，我們接著想知道另一種可能性，baicalein 抑制 12-LOX 的活 性是否與其導致細胞凋亡有關；之前也有相關研究發現，在人類的乳 腺腫瘤細胞中，專一性地抑制12-LOX 可以誘導 cytochrome c 的釋放 和活化caspases，最後也會促進細胞的凋亡 (Tong et al., 2002)。於是 我們使用12-LOX 下游的活性產物 12-HETE，模擬 12-LOX 的活性並 未被baicalein 抑制時的情況；而會選擇 12-HETE 的原因則是，12-LOX 此 酵 素 會 將 arachidonic acid (AA) 代 謝 成 具 有 生 理 活 性 的 12-hydroperoxyeicosatetraenoic acids (12-HPETEs) ， 接 著 再 還 原 為 12-hydroxyleicosatetraenoic acid (12-HETEs)，所以我們可用 12-HETE 的有無來模擬12-LOX 本身的活性，而之前也已經有過使用 12-HETE
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來模擬12-LOX 的相關研究(Henry et al., 2007)。來而實驗結果發現，
12-HETE 雖然對於細胞的生長變異影響不大(Fig. 7)，但是可以有意義 的回覆 baicalein 導致的細胞存活率下降(Fig. 8)。由以上結果可以推 論，抑制12-LOX 的確是 baicalein 導致小鼠黑色素瘤細胞死亡的原因
胞的12-LOX被抑制後，將會導致細胞產生細胞凋亡(Benjamin Chun et al., 2001)；另外有研究發現baicalein會因為抑制 12-LOX，進而誘導人 亡的主要原因就是baicalein 會產生 ROS，以及 baicalein 對於 12-LOX 的抑制作用，兩者皆會造成細胞的死亡。
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另外我們進一步使用siRNA 的技術，將 12-LOX 的蛋白表現量降低，
結果發現當我們將12-LOX siRNA 後，接著給予 baicalein，E 控制組 的細胞死亡率反而比12-LOX siRNA 組來得高(Fig. 12)；加上之前的 研究發現小鼠黑色素瘤細胞pretreated 12-LOX siRNA 後，baicalein 就 無法使其產生ROS 了(Chou et al., 2009)，如此或許可以說明一件事，
當細胞pretreated 12-LOX siRNA 後，給予的 baicalein 就無法有效作 用到 12-LOX 上，最後細胞無法產生過量的 ROS，所以存活率比較 高；換句話說，baicalein 產生的 ROS 必須透過 12-LOX，而 baicalein 本身抑制12-LOX 的特性可能並不是單純降低 12-LOX 的蛋白表現。
而給予baicalein 的 E 控制組細胞存活率大幅度低於 12-LOX siRNA 後 的細胞，這或許更說明另一件事，baicalein 造成的 B16F10 黑色素瘤
細胞死亡主要原因可能是 ROS，所以此死亡是以細胞壞死為主，細
胞凋亡可能僅佔其中一小部分。
為了證實上述的推論，baicalein造成的B16F10黑色素瘤細胞死亡主要 原因是ROS，且此死亡是以ROS導致的細胞壞死為主；我們用了流式 細胞儀來分析小鼠黑色素瘤細胞在baicalein的作用下，其細胞的死亡 種類分佈，結果發現大部分的死亡細胞都是細胞壞死，而細胞凋亡僅 佔其中一小部份。但是也有研究提到，baicalein要與Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL)共同作用後才會有 更佳的誘導癌細胞凋亡效果，因為baicalein可以抑制癌細胞中的 TRAIL阻抗性，造成癌細胞的凋亡大幅增加 (Hiroya et al., 2008) 。
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