第三章 材料與方法
3.5 肺泡灌洗液
小鼠於呼吸道阻力測試後 24 小時進行犧牲，先以前述方式於小鼠臉頰採血 檢測 IgE 抗體濃度，隨後用腹腔注射方式以 50mg/kg 的 pentobarbital 進行麻醉。
將小鼠固定於犧牲台上，以剪刀剖開喉部表皮及肌肉露出氣管，切開氣管後以採 血軟針置於氣管內固定，用 PBS 溶液灌洗。肺泡灌洗共三次，第一次使用針筒 把 1cc PBS 溶液灌入肺臟，來回沖洗三次。第一管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid , BALF)共 1cc，用離心管收集後暫置於冰上，於 4℃的狀態以 1000 rpm 離心 10 分鐘，分裝其上清液 150µl 及 40µl 分別用於檢測 150µl cytokine (IL-13)、
總蛋白含量(total protein)，餘下肺泡灌洗液保留。第二、三次肺泡灌洗方法相同，
使用針筒把 1cc PBS 溶液灌入肺臟，來回沖洗三次，第二、三次的肺泡灌洗液收 集於第二支離心管內，共 2cc。至此將第一管留下的肺泡灌洗液混入第二支離心 管內，兩管均勻混合後，得到包含全部細胞的肺泡灌洗液，用於評量肺部發炎及 傷害指標，取 100µl 測量總死亡細胞數，取 200µl 進行血球分類計數，另取 40µl 測總蛋白含量。而評量氣喘程度的生理指標，則分別取肺泡灌洗液 40µl 測 IgE 抗 體及 150µl 測細胞因子(IL-13)濃度。
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3.5.1 肺泡灌洗液中總死亡細胞數
總死亡細胞數的計算必須在肺泡灌洗液取得後儘快完成，以確保活細胞不會 逐漸凋亡，增加死細胞數目，而造成計算上的誤差。將100µl 肺泡灌洗液與100µl trypan blue染劑1:1均勻混合後，取100μl注於血球計數盤(Hemocytometer )(圖3) 計數，並蓋上蓋玻片(Coverslip)。血球計數盤上有二個九宮格空間，每個九宮格 空間被平均細分為9個1 mm2大小之正方形，其中位於四個角落之正方形再被細 分為16個小格，深度皆為0.1 mm。當九宮格空間上方被蓋上蓋玻片後，每個大正 方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm = 1 x 10-4 ml 。由於死亡細胞的細胞膜通透性改變，
因此trypan blue染劑可以進入細胞而呈色，活細胞無法被染劑染色，因此呈現為 透明狀。
使用顯微鏡觀察時，會計算五個大正方形內之染色細胞數目，再除以大方格 數，求得一個大正方形內之平均染色細胞數目，乘以稀釋倍數2，再除以1 x 10-4 ml，
即為每 ml 中之死亡細胞數目(細胞數/ml)。
計算公式：
死亡細胞總數/ml＝(五個正方形之染色細胞數/5) x 稀釋倍數2 / 10-4
3.5.2 肺泡灌洗液中血球分類計數
取得 200µl 肺泡灌洗液後，需要用離心機將細胞固定於玻片上，用顯微鏡觀 察並分別計算嗜中性白血球(neutrophil)、單核白血球(monocytes)、淋巴細胞 (lymphocyte)及嗜酸性白血球(eosinophil)之比率。其中嗜中性白血球及單核白血 球皆為肺部發炎及傷害指標，嗜酸性白血球則是氣喘程度的生理指標。先將肺泡 灌洗液震盪均勻後，使用低速細胞離心機(cytospin)以 600rpm 離心 5 分鐘，再以 熱風吹玻片背面使細胞熱固定，以劉氏染劑(Liu’s stain)染色，先用一體積染劑
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A(stain A)染 30 秒，再用二體積染劑 B(stain B)染 90 秒，以清水輕輕沖洗，靜置 風乾後即可用顯微鏡觀察。每個檢體皆會重複製作二片玻片，每片玻片會計算總 共 200 個細胞，並按前述四種細胞進行分類，同一檢體的二片玻片結果在計算平 均後，即可得該種細胞佔總細胞之百分比。
計算公式(以嗜中性白血球為例)：
嗜中性白血球比率(%)＝(二片玻片中嗜中性白血球總數/2)/ 200 個細胞 x 100%
3.5.3 肺泡灌洗液中細胞因子 IL-13
細胞因子 IL-13 是氣喘程度的生理指標，使用 Mouse IL-13 ELISA Set(R&D Systems, Inc.)進行檢測。
Assay Procedure 檢測程序：
1. 把 reagents， standard dilutions，control 及 samples (150µl 肺泡灌洗液)準備好。
2. 把 plate frame 從鋁箔包取出， 餘下的重新密封。
3. 將 50µl Assay diluent RD1-14 加入每個 microwells(微孔)。( RD1-14 含有不溶 物質， 使用前先震盪)
4. 把 50µl *2 的 standard、sample 和 control 加到適當的 wells； 密封 plate， 輕 輕拍打邊框 1 分鐘及培養於室溫 2 小時。
5.沖洗 wells， 每個 well 用 400µl 的 wash buffer 去洗 5 次；洗完最後一次後，把 plate 倒置和印在吸水紙上，盡量去掉任何殘留液體，以免殘留液體稀釋下一個 藥劑。
6. 將 100µl Mouse IL-13 Conjugate 加入每個 well。密封 plate 及培養於室溫 2 小 時。
7. 重複第 5 步的吸/洗。
8. 將 100µl Substrate Solution 加入每個 well。避光及培養於室溫 30 分鐘。
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(Substrate reagent A+B 等體積配製，須在配製後 15min 內使用，反應後失效) 9. 將 100µl Stop Solution 加入每個 well。輕輕拍打邊框使混合均勻。
10. 在 30 分鐘內停止反應，讀 450nm 的吸光值。
3.5.4 肺泡灌洗液中總蛋白數
Total protein 是肺部發炎及傷害指標，使用 Bio-Rad Protein Assay(BIO-RAD，
1-800-4BIORAD)進行檢測。
Assay Procedure 檢測程序：
1. 用 BSA(Bovine serum albumin)配製檢量線，共 5 個濃度分別為 0、0.2、0.4、
0.6 及 0.8 mg/ml 。
2. 將準備好的標準品和 sample 各 10µl 注入適當的 well。
3. Rad protein 染劑與水以 1：4 比例混合。
4. 之後將 200µl Rad protein 染劑加入 well，靜置 5 分鐘以上，不超過 1 小時。
5. 讀 595nm 的吸光值。