成分分析
促進膠原蛋白合成之作用 促進纖維母細胞增生之作用 清除過氧化氫能力 清除超氧陰離子能力之測定 DPPH 清除 自由基能力測定 抗老化、抗氧化之功效： 酪胺酸酶活性抑制試驗 萃取液對美白之功效：
抑
制黑色素細
胞生成黑色素之影響 紫外線對於細胞存活率之影響： 皮膚纖維母細胞經紫外線後之存活率 添加抗氧化物質及萃取液對皮膚纖維 母細胞存活率之影響
二、實驗材料與藥品 2.1. 萃取之材料與藥品
本次實驗所使用的動科所的猪隻胎盤
(2)二次水
(3) Phosphate buffer (4)NaCl
2.2. 分析胎盤之成分試劑 2.2.1. SDS-PAGE
0.1 M Potassium phosphate buffer (pH 7.6):1 M K2HPO4 86.6 ml 和 1 M KH2PO4 13.4 ml 以水調整至最後體積為 1 升。
4×SDS gel-loading buffer:200 mM Tris․Cl (pH 6.8) 、400 mM dithiothreitol、8% SDS、0.4% bromophenol blue、40% glycerol Dithiothreitol 未添加前可長期儲存於室溫。使用前再添加 Dithiothreitol。
5×Tris-glycine electrophoresis buffer:將 15.1 g Tris base 和 94 g glycine 溶於 900 ml 二次水(ddH2O)，加入 50 ml 10% SDS，
然後以水調整最後體積為1 升。
Coomassie Blue staining solution:將 0.25 g Coomassie Brilliant Blue R250 溶於 90 ml 的 methanol: H2O (1:1)混合液，再加入
10 ml glacial acetic acid。以 Whatman No.1 Filter 過濾後儲存於 室溫。
Destain solution:ddH2O 450 ml、methanol 450 ml、glacial acetic acid 50 ml。
2.2.2. Western Blotting
Phosphate-buffered saline (PBS):將 8 g NaCl、0.2 g KCl、
1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4 溶於 800 ml 的二次水，
利用HCl 調整 pH 至 7.4，以水調整最後體積至 1000ml。
高壓滅菌30 分鐘。
Transfer buffer:39 mM glycine、48 mM Tris base、0.037%
SDS (electrophoresis grade) 、20% methanol。
Blocking Solution: 5% (w/v) skim milk、0.2% Tween 20 in PBS。
“Developer and replenisher ” solution: (KODAK)
將100 ml “developer and replenisher ”與 400 ml 的二次水 混合。
“Fixer and replenisher ” solution: (KODAK)
將100 ml “fixer and replenisher ” 與 400 ml 的二次水混 合。
2.3 抗老化功能測定試劑
2.3.1. 清除 DPPH 自由基能力測定試劑
1,1-diphenyl-2-picryl – hydrazyl（DPPH）（Sigma D-9132）
95% Ethanol (景明化工)
L-ascorbic acid（Sigma A-0278）
α- tocopherol （95%, Sigma T-3251）
2.3.2. 清除超氧陰離子試劑
Pheaazine methosulphate (PMS; Sigma P9625)
(Dihydronicotinamidadenin dinucleotide (β-NADH; Sigma N-4505)
Nitro-blue tetrazolium (NBT; Sigma N-6639) L-ascorbic acid (Sigma A-0278)
Sodium phosphate buffer 2.3.3. 過氧化氫清除能力測定試劑
H2O2、Horseradish peroxidase-phenol red (Sigma P-6782; 1000 units/mg solid)
Phenol red (Sigma P-4633)
Catalase (13600 units/mg solid, Sigma C-40) 2.3.4.萃取物對促進膠原蛋白合成之作用
Collagen assay kit (伯新)
2.4. 細胞培養與分析之藥品 2.4.1. 細胞株
本 實 驗 所 使 用 的 細 胞 株 為 附 著 性 老 鼠 皮 膚 纖 維 母 細 胞 NIH 3T3，購自食品工業研究所菌種中心; 附著性老鼠黑色素瘤細胞 B16-F0，購自食品工業研究所菌種中心。
2.4.2.細胞培養藥品
Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM, Gibco , 1159375)
Foetal Calf Serum(FBS, Gibco ,715480) Bovine Serum(CS , Gibco , 427252)
PSN Antibiotic Mixture (Gibco , 1189496) 2.5. 美白的有效性測試
2.5.1 .萃取液對於酪胺酸酶活性的影響 Tyrosinase (Sigma, T7755) Tyrosine (Sigma, T3745) KH2PO4 (igma, P0622) Na2HPO4 (Merck,F862086) α-Tocopherol (Sigma, T3251)
2.5.2. 萃取物對抑制黑色素細胞生成黑色素的影響 NaOH(Merck, B578898)
DMSO(景明化工)
2.6. 皮膚纖維母細胞經 UV 照射模式測試 2.6.1. 細胞照射 UVA 和 UVB 後之存活率
UVA 燈管(365nm，1350µw/cm2) (伯新) UVB 燈管(365nm，1500µw/cm2 )(伯新) Tyrpan blue
2.6.2. 添加抗氧化物質對細胞存活率之影響 α-tocopherol(Sigma, T3251) Vit C
Catalase Tyrpan blue 2.7. 實驗儀器與材料
恆溫水浴槽 冷凍乾燥機
高速離心機 (Hitachi CR-21) 小型離心機
試管震盪機 微量定量吸管 無菌無塵操作台 直立式殺菌釜 恆溫箱
50 ml 無菌離心管(TPP 與 orange) 血球計數器
倒立式顯微鏡 二氧化碳培養箱
離心機 (Cimac CR-21, Hitachi) 分光光度計 (U-2000, Hitachi) 酸鹼度計
-80℃冷凍櫃 (Nuair) 液態氮桶
細胞用 6-well 培養皿 (orange ) 10 公分培養皿
6 公分培養皿
凍結細胞用小管 (Nalgene 5000-0020) 紫外燈 (UVA 365 nm；UVB 302 nm ) ELISA 判讀器
無菌過濾器
0.22μm 無菌過濾膜
三、實驗方法 3.1. 猪隻胎盤萃取
將取得之猪隻胎盤，先用PBS(pH 7.4)清洗，再用均質機攪碎，
且轉速不能快，攪完之後馬上，拿去冷凍乾燥或直接萃取。而萃取時，
使用不同的溶劑(如不同濃度之 NaCl、PBS)，在冷房(cool room 4℃) 中進行(overnight)；然後利用高速離心機將胎盤碎片移除，取上層液 來進行各種分析。
3.2. 猪隻胎盤成分分析
3.2.1. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of proteins
【Preparation of SDS-polyacrylamide gel】
Resolving-gel solution:
15% : for 4 ml
Components Volume (ml)
ddH2O 0.88
30% Acrylamide mixture 2 1.5M Tris (pH 8.8) 1.04
10% SDS 0.04
TEMED 0.0016 10% APS 0.04
Stacking-gel solution:
5% : for 3 ml
Components Volume (ml)
ddH2O 2.1
30% Acrylamide mix 0.5 1M Tris (pH 6.8) 0.38
10% SDS 0.03
TEMED 0.003 10% APS 0.03
1. 將玻璃及鋁板依造操作手冊組裝起來。
2. 注入 3.5 ml 的 resolving-gel solution 於玻璃與鋁板間的溝槽，
再以300µl 的 isopropanol 覆蓋其表面，靜置 30 分鐘以待其凝 結完全。
3. 倒掉覆蓋的 isopropanol 並側立等待其完全蒸發。
4. 注入適當體積的 stacking-gel solution 於凝結完全的 resolving gel 上，立即在 stacking-gel solution 中斜插入 Teflon comb，小 心避免產生氣泡。
5. 再注入 stacking-gel solution 以完全充滿 comb 的間隙。
6. 靜置 30 分鐘，待其凝結後小心移開 comb，然後立即以二次水 清洗以去除殘留未凝結的acrylamide。
【Electrophoresis of samples】
1. 將凝結完成的 gel 連同玻璃、鋁板架設於電泳槽上，小心倒入 Tris-glycine electrophoresis buffe，並小心去除藏匿於 gel 下方 的氣泡。
2. 將 sample 與 4× SDS gel-loading buffer 混合後，在 100℃的沸 水中靜置 6 分鐘以確保蛋白質完全 denature。
3. 然後立即離心 2 秒後，將殘留於管壁上的 sample，spin down 下來。
4. 將 sample 注入 well 中。
5. 先以 100 volt 進行蛋白質電泳，當 dye 通過 stacking gel 要進 入 resolving gel 時，將電壓增加至 150 volt。
6. 當 bromophenol blue 到達 resolving gel 的底部時，將電源供應 器關上。
7. 小心將 gel 自電泳槽取下。
【Staining with Coomassie brilliant Blue】
1.小心切下 stacking gel，並將 resolving gel 浸泡於 Coomassie Blue staining solution。
2.回收 staining solution。
3.將 gel 浸泡於 destain solutionⅠ，並置放於緩慢擺動的 orbital shaker 1 小時。
4.將 destain solution 倒掉，再將 gel 浸泡於二次水，並置放於緩慢 擺動的orbital shaker 數十分鐘，直至背景完全去除。
5.將 gel 以玻璃紙密封起來，以長期儲存。
3.2.2. Western Blotting
【Transfer of proteins from SDS-polyacrylamide gel to PVDF membrane】
1. 剪下一塊與 gel 相同大小的 polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane。
2. 將剪下的 membrane 以 methanol 潤溼 15 分，然後浸泡於二次 水1 分鐘，最後置放於 transfer buffer 中。
3. 將 2 片 Whatman 3MM paper 及多孔性襯墊(porous pad)浸泡於 transfer buffer 中。
4. 當 SDS-polyacrylamide gel 電泳完成後，將 resolving gel 以二 次水 rinse，然後浸泡於 transfer buffer。
5. 依以下步驟將 transfer apparatus 裝置起來: (不時以 transfer buffer 潤溼並避免氣泡產生)。
a. 將裝置板平攤於桌面。
b. 將一片浸泡於 transfer buffer 中的多孔性襯墊平放於 black electrode(陰極端)上。
c. 再將一張浸泡於 transfer buffer 中的 3MM paper 平放於多 孔性襯墊上。
d. 再將 gel 平鋪於 3MM paper 上。(正面朝下) e. 將 PVDF membrane 確實的覆蓋於 gel 上。
f. 再將另一片 3MM paper 覆蓋於 PVDF membrane 上。
g. 最後將另一片多孔性襯墊覆蓋於 3MM paper 上。
h. 將 colorless electrode (陽極)覆蓋於多孔性襯墊上。
i. 將 transfer cassette 夾好並放入 transfer apparatus 中。
6. 打開電源供應器，以 400 mA 電流進行 transfer。
7. 將電源供應器關掉，並取出 transfer cassette。
8. 將 PVDF membrane 浸泡於 blocking solution。
【Blotting】
1. 將 membrane 浸泡於 25 ml 的 blocking solution 中，並置放於 緩慢運轉的orbital shaker 上 1 小時。
2. 以 PBS buffer 清洗掉未吸附殘留的 blocking buffer，並置放於 緩慢運轉的orbital shaker 上 5 分鐘。重複 3 次。
3. 將 membrane 浸泡於含有 4 µl primary antibody 的 10 ml
blocking buffer，然後置放於緩慢運轉的 orbital shaker 上 1 小 時，以讓primary antibody 得以吸附於 target protein 上。
4. 以 PBS buffer 清洗掉未吸附殘留的 blocking buffer 以及 primary antibody，並置放於緩慢運轉的 orbital shaker 上 5 分 鐘。重複2 次。
5. 將 membrane 浸泡於含有 2 µl HRP-labled secondary antibody 的10 ml blocking buffer，然後置放於緩慢運轉的 orbital shaker 上1 小時。
6. 以 PBS buffer 清洗掉未吸附殘留的 blocking buffer 以及
secondary antibody，並置放於緩慢運轉的 orbital shaker 上 5 分 鐘。重複2 次。
【ECL Immunodetection】
1. 將 membrane 平鋪於投影片上，含有蛋白質的那一面朝上，吸 乾多餘的buffer。
2. 將 0.75 ml 的 ECL detection solutionⅠ和 ECL detection solution
Ⅱ(Pharmacia)加於 1.5-ml tube 中，vortex 混合均勻。
3. 將 detection mixture 滴於 membrane 上。
4. 不時擺動投影片，使 detection mixture 充分佈滿 membrane。
5. 吸掉多餘的 detection reagent，並包覆一層投影片於 membrane 上，將電燈關掉，再覆蓋一層底片後於暗房1~3 分。
6. 快速地移開底片，並浸泡於“developer and replenisher ” solution 中，使之顯影，再以清水清洗。
7. 再將底片浸泡於“fixer and replenisher” solution 中 90 秒，使之 定影，再以清水清洗。
8. 直立底片並靜置使之乾燥。
3.3. 細胞培養
3.3.1. 附著性細胞之培養
將附著性細胞以DMEM 培養基 (含 5% FBS) 培養於 37oC、5% CO2
濃度下之細胞株以倒立式顯微鏡觀察，當細胞長滿為單層 (monolayer)
時，即可進行繼代培養 (subculature)。在無菌操作台 (laminar flow) 內，以抽氣機吸去上層液，再以5 ml phosphate-buffered saline (PBS) 洗細胞兩次，然後吸去PBS 並加 1 ml 胰蛋白酶(trypsin)，前後左右搖 晃培養皿使胰蛋白酶均勻分散於細胞層，同時吸走部份胰蛋白酶，並 置於培養箱中約1 鐘後，輕拍培養皿同時以倒立式顯微鏡觀察，待細 胞層脫落並浮起時，加入2ml FBS 並吸放多次以沖散細胞，將細胞與 培養基培養，約2-3 天細胞長滿，即可再行繼代培養。
3.3.2. 細胞的繼代培養
將培養皿內培養液吸取棄去，加入PBS 液沖洗，重覆二次，吸去 PBS 液後，加入胰蛋白酶，置於 CO2培養箱，1 分鐘後輕拍皿底至細 胞全漂浮起為止。立即加入培養基並混合均勻後，分裝於培養皿內，
加入適量的培養液再行培養。
3.3.3. 細胞解凍與保存
將冷凍管置於37℃水浴槽中迅速解凍後，以 75％酒精擦拭管壁及 管口，在無菌操作台內將解凍的細胞吸到含有9 ml 之 DMEM 培養液 直徑10 cm 培養皿中，放入 37 ℃、5 ％CO2之培養箱中培養並在解 凍培養24 小時內更換培養基。
欲保存之細胞以 trypsin 來懸浮細胞，將此細胞懸浮後以細胞計 數器(hemacytometer)計算細胞數目，並取約 1×106個到無菌的離心管 中以1000g 離心 10 分鐘，移去上清液後以 1 ml 之 DMEM 之冷凍培 養液 (含 DMEM, 10％ FBS 與 7% DMSO)均勻懸溶後，移到冷凍管 中，置於-80℃冰櫃 24 小時內再移至液態氮桶內保存。
3.4. 抗氧化及抗老化能力評估
3.4.1. 清除 α , α- diphenyl-β-picryhydrazyl (DPPH)自由基之效果
(Shimada et al., 1992；Bonina et al., 1998；Aquino et al., 2002) 取不同濃度(0.05 ~ 1 mg/mL)的 500 µL 猪隻胎盤萃取液加入 500 µL 新 鮮配置的0.2 mM DPPH 之乙醇或水溶液，均勻混合靜置 30 分鐘後，
使用分光光度計(Spectrophotometer U-2000, Hitachi)檢測 517 nm 之吸 光值。控制組以1 mL 的乙醇或一次水取代。吸光值越低表示樣品清 除DPPH 自由基的能力越強。
清除率(scavenging effects)＝( (控制組 A517nm-樣品 A517 nm 吸光值) / 控制組A517nm 吸光值)× 100
3.4.2. 清除超氧陰離子能力之測定
以0.1 M phosphate buffer (pH 7.4)配製 120μM 之
phenazinemethosulphate (PMS)、936 μM 之 NADH 及 300 μM 之 nitro-blue tetrazolium (NBT)。將萃取物以 phosphate buffer 溶在不同濃 度之溶液。取500 µL 的猪隻胎盤萃取物 (0.05 ~ 1mg/mL)，依序加入 500 µL 的 PMS、NADH 及 NBT 溶液，混和均勻，控制組以 500 µL phosphate buffer 取代。在室溫下靜置 3 分鐘後，使用分光光度計 (Spectrophotometer) 檢測 560 nm 的吸光值。吸光值越低表示樣品清 除超氧陰離子的能力越強。(Liu and Ng, 1999；Sanchez, C.2002) 清除率(scavenging effects)＝((控制組於 A560吸光值-樣品於 A560 nm 吸
光值) /控制組於 A560nm 吸光值)× 100 3.4.3. 清除過氧化氫能力
取猪隻胎盤萃取物 1 mL 加入 H2O2溶液0.4 mL，均勻混合，於室溫 下靜置20 分鐘，添加 0.6 mL 的 Horseradish peroxidase-phenol red(0.5
mg/ml HRPase 1 mL；7.5 mM phenol red 2 mL) 混合液，均勻靜置 10 分鐘，再冰浴10 分鐘後，以分光光度計測其在 610 nm 的吸光值。控 制組以1 mL 乙醇取代。吸光值越低代表清除過氧化氫的能力越強。
(Pick and Keisari, 1980；Souheil, et. al.2002)
清除率(scavenging effects)＝((控制組於 A610 nm 吸光值-樣品於 A610
nm 吸光值) /控制組於 A610 nm 吸光值)× 100 3.4.4.萃取液對促進纖維母細胞增生之作用
準備6-孔的培養盤，分別於每一孔中接種 6 x 104個纖維母細胞，置 於37℃、5% CO2培養箱內培養。觀察添加不同溶劑萃取的萃取液，
在不同的時間12、24、48、60、84、108 小時下，對纖維母細胞增生 的情形，以 tyrpan blue 測驗法檢測。經過 48、96 小時，需更換新鮮 的培養基。
3.4.5.萃取液對促進膠原蛋白合成之作用
參考(Li et al., 2001；Yamamoto and Nishioka, 2001； Blease et al., 2002)於其研究中均曾使用此套件(Kit)來測量膠原蛋白生成量的作 法。準備6-孔的培養盤，分別於每一孔中接種 6 x 104個纖維母細胞，
加入不同溶劑萃取的萃取液，於37 oC、5％ CO2 培養箱培養分別培 養24 小時和 48 小時。另外，以只用基本培養基者作為對照組。以上 述方法，測量培養之纖維母細胞中膠原蛋白之含量，來瞭解其促進膠
加入不同溶劑萃取的萃取液，於37 oC、5％ CO2 培養箱培養分別培 養24 小時和 48 小時。另外，以只用基本培養基者作為對照組。以上 述方法，測量培養之纖維母細胞中膠原蛋白之含量，來瞭解其促進膠