本研究使用莫氏水迷津(Morris water maze, MWM)來探討大氣微粒對中樞神經 的影響，此行為實驗廣泛應用於評估空間學習及記憶能力。 爬上平台所需時間，此時間為逃避潛伏期(escape latency)，小鼠於 60 秒內尋找到平 台後，讓小鼠在平台上停留 15 秒，若小鼠超過 60 秒仍未尋找到平台，則引導小鼠
限時間(Time spent in target quadrant)、目標平台象限次數(Cross numbers in target (desferrioxamine, DFO)避免 DNA 持續氧化，以研磨棒均質化腦組織，於 65℃反應 1 小時增加 DNA 產率，反應期間不時手動搖晃直到溶液轉為透明，再加入 4 μL 20 mg/mL 核糖核酸酶 A (RNase A)水解 RNA，於 37℃作用 1 小時，加入 200 μL DNA 結合緩衝液(DNA binding buffer)及 200 μL 100%乙醇(ethanol)，將溶液全數轉移至 DNA spin column，以 16,100 g 4℃離心 1 分鐘後丟棄離心流出的液體，加入 500 μL 清洗緩衝液 1 (wash buffer 1) 以 16,100 g 4℃離心 1 分鐘，再加 500 μL 清洗緩衝液 2 (wash buffer 2) 以 16,100 g 4℃離心 6 分鐘，將其餘雜質洗出，再把 spin column 放至新的 1.5 mL 微量離心管，加入 40 μL 不含核酸酶的水(nuclease-free water) 於 65℃反應 5 分鐘，以 16,100 g 4℃離心 1 分鐘沖提出 DNA，沖堤的步驟共進行三 次。接下來使用微量分光光譜儀(NanoVue Plus Spectrophotometer, Biochrom)測量萃 取出的 DNA 濃度及純度，於波長 260 nm 測量吸光值得知 DNA 濃度，以 A260/A280 比值得知 DNA 純度，並採用純度介於 1.6-2.0 的 DNA 樣本萃取 OHdG 及 8-NO2Gua。
8-OHdG 萃取
萃取的 DNA 加入 20 μL 15N5-8-OHdG (25 ppb)及13C215N-8-NO2Gua (1 ppm)作 為同位素標記內標準品，加入10 μL 濃度為 10 U/μL 的核酸酶 S1 (nuclease S1)於 37℃反應 2 小時。再加 10 μL 10X 鹼性磷酸酶緩衝溶液(alkaline phosphatase buffer) 及0.2 μL 鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)，於 37℃反應 2 小時後，以 10 μL 0.1N 鹽酸(Hydrochloric acid, HCl)中和溶液、1 mL 去離子水(ddH2O)稀釋樣品及加入 75 μL 1M 醋酸銨溶液(ammonium acetate buffer, pH 5.25)。[58-60]
稀釋後的 DNA 樣品以 Sep-Pak C18 Vac Cartridge (100 mg/1 mL Waters; Milford, MA)進行固相萃取，管柱加入 100%的甲醇(Methanol)及 1 mL ddH2O 預處理，再將 spectrometry, LC-MS/MS)分析 8-OHdG 及 8-NO2Gua，液相層析儀利用分析物和分 離 管 柱 間 非 共 價 性 質 交 互 作 用 力 的 不 同 ， 在 移 動 相 (mobile phase) 流 過 靜 相 (stationary phase)時，樣品中不同物質移動速率與滯留時間(Retention time)的差異將 物質分離，液相層析儀流出的樣本即送入質譜儀，樣品經過離子源(ion source)被離
子化，轉為帶電荷的離子與惰性氣體碰撞斷裂成碎片，再依照荷質比不同進行分離，
進入第二個串聯質譜，偵測器會根據特定破碎的模式解讀推知碎裂前結構，二次質 譜串聯可以降低干擾並提升偵測靈敏度。液相層析使用 Syncronis C18 管柱(150×
4.6 mm, Thermo Fisher Scientific)，有機相為甲醇含 0.01 %甲酸、水相為水含 0.01%
甲酸，流速為 500 μL/min，每次分析需要 10 μL 樣品，分析時間為 10 分鐘，以表 2 的移動相濃度梯度將物質分離，0 分鐘時有機相比例設為 10%、第 0-1 分鐘有機 相比例維持 10%、第 1-3 分鐘時有機相比例從 10%提升到 50%、第 3-5 分鐘有機 相提升為 98%、5-7.2 分鐘有機相比例維持 98%、7.2-7.5 分鐘有機相降為 10%，第 7.5-10 分鐘有機相維持 10%。質譜儀的游離源使用加熱式電噴灑游離法(Heated Electrospray Ionization, HESI)，並以選擇反應監測(selected reaction monitoring, SRM) 模式進行質譜分析，LC-MS/MS 的 8-OHdG、8-NO2Gua 母離子 (Precursor ion)、
子離子 (Product ion)、碰撞能量(Collision energy)、管徑電壓(Tube lens)及游離源參 數如表 3、表 4。將 8-OHdG、8-NO2Gua 檢量線配製為 10 個濃度：0.02 ppb, 0.03 Scientific Inc.)進行分析。8-OHdG 定量極限(Limit of Quantification, LOQ)與偵測極 限(Limit of Detection, LOD)分別為 0.1 ppb 及 0.03 ppb，8-NO2Gua 定量極限及偵測 極限為 0.5 ppb 及 0.2 ppb，若濃度介於 LOQ 與 LOD 之間，數值以 1/2 LOQ 代入 計算進行統計分析，濃度低於 LOD，數值則以 1/2 LOD 代入。
HPLC-UV 分析方法
本研究使用高效液相層析儀(High performance liquid chromatography, HPLC)、
Hypersil BDS C18 管柱(150×4.6 mm, 5 μm, Thermo Fisher Scientific)，以及紫外光/
可 見 光 (UV/VIS) 偵 測 器 (Jasco UV-975, Japan) 於 波 長 254 nm 分 析 去 氧 鳥 苷 (deoxyguanosine, dG)和鳥嘌呤(guanine)，有機相為乙腈、水相為 50 Mm 甲酸銨水 溶液，使用流速為 1 mL/min，每次分析需 10 μL 的樣品，分析時間為 20 分鐘，第 用酵素免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測定腦中乙型類澱 粉蛋白濃度，並利用免疫組織化學染色法(Immunohistochemistry, IHC)檢測腦中類 澱粉蛋白斑塊及神經纖維纏結現象。
3.6.1 乙型類澱粉蛋白測定
因小鼠腦組織量不足，酵素免疫分析法僅分析腦中 Aβ42，其為較早形成之阿 茲海默症病徵。分析前，加入腦組織質量 8 倍之均質緩衝液(homogenization buffer)，
成分為 5 M 鹽酸胍(Guanidine-HCl, SIGMA)、50 mM 三羥基氨基甲烷(Tris-base, pH 8.0)及蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail Tablet, Roche)，使用研磨棒將腦組織 均質化，於 16,000 g 離心 20 分鐘，取出上清液置於微量離心管儲存於-80℃冰箱。
總蛋白質(Total Protein)
將 1 μl 上清液加入 999 μl 稀釋 5 倍之染劑(Bio-rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, BIO-RAD)且均勻混合，再取 150 μl 稀釋後上清液至 96 孔盤(96-well plate)，並以牛血清蛋白標準品(Bovine Serum Albumin Standards, Thermo Fisher